《原核表达实验》PPT课件

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1、实验一：大肠杆菌表达载体的构建及融合蛋白诱导表达生命科学技术学院张忠明朱辉袁松丽2010年6月黑曲霉的优化培养总DNA或RNA的抽提PCR或RT-PCR扩增xynB基因目的基因的TA克隆质粒pMD-xylBEcoRI+XhoI双酶切凝胶回收试剂盒回收目的片断xynB乙醇沉淀回收线性化片断大肠杆菌表达载体pET-28(a)+酶连酶连产物转化E.coliDH5挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒(PCR及酶切验证)28S18S重组表达质粒转化E.coliBL21挑取重组子,用菌落PCR方法验证IPTG诱导促使目的大量蛋白表达细胞破碎及蛋白抽提目标蛋白的纯化蛋白质浓度测定--Bradford法目标

2、蛋白的鉴定—Westernbiotting融合蛋白诱导表达流程图XylBCK100mMIPTG1mlLB+Kan1-I1+I2+I3+ICk+I2-I3-ICk-I37℃,O/N37℃,2.7h37℃,2.7h37℃,O/N30℃,4h28℃,4h1mlLB+Kan3ul150ul3ul3ul3ul50mlLB+KanIPTG100mM使用浓度0.1mMKan100mg/ml使用浓度50μg/mlPBS缓冲液：137mMNaCl2.7mMKCl10mMNa2HPO410mMKH2PO4试剂及缓冲液：3×SDS缓冲液：187.5mMTris-HCl(pH6.8,25℃)6%w/vSDS30%

3、甘油0.03%w/v溴酚蓝GelStainingBuffer(每100ml):考马斯亮蓝250mg甲醇45ml乙酸10ml水45mlGelDestainingBuffer:甲醇100ml乙酸100ml加水至1000mlSDS-PAGE胶：30%聚丙烯酰胺10%SDS1.5MTris-HClpH8.80.5MTris-HClpH6.810%过硫酸铵（现配）TEMEDTris-甘氨酸电泳缓冲液25mmol/LTris250mmol/L甘氨酸（电泳级）（PH8.3）0.1%SDS可配成5×贮存液备用，在900ml去离子水中溶解15.1gTris碱和94g甘氨酸，然后加入50ml10%（w/v）的

4、电泳级SDA贮存液，用去离子水补至1000ml。操作步骤1：（小规模诱导-筛选正确表达克隆子）1、从平板上挑取1个pET28-xylB/BL21转化子接种于装有2mlLB/Kan（Kan浓度50ug/ml）培养基的PA瓶中，37oC，250rpm，培养过夜；2、取过夜培养物按1%接种量分别转接二个装有20mlLB/Kan的PA瓶中，37℃培养约2小时40分钟；3、培养结束后，分别向其中一个瓶加入IPTG（终浓度0.1mM）并标记为“+I”，另一瓶不加IPTG标记为“-I”，28℃培养，250rpm，约4小时后收集菌体；4、从“+I”、“-I”培养瓶中各吸取1ml菌液于两个标有“+I”、“-

5、I”的1.5ml离心管中,离心收集菌体,10000rpm、RT、1分钟，去上清，加入80ul缓冲液和40ul3×SDS上样缓冲液悬浮菌体，-20℃保存备用。1、挑取1个正确表达目标蛋白的转化子接种于装有2mlLB/Kan（Kan浓度50ug/ml）培养基的PA瓶中，37oC培养过夜；2、按1%接种量接种于50mlLB/Kan（Kan浓度50ug/ml）中37℃培养约2小时40分钟，OD600=0.4-0.6；（前两步与操作步骤1相同）3、培养完毕后，向三角瓶中加入IPTG（100mM）50μl，使培养液中IPTG终浓度为0.1mM；28℃诱导培养，250rpm，约4小时后收集菌体；4、吸菌

6、液1ml于1.5ml离心管中，另取20ml倒入50ml离心管中,离心收集菌体,8000rpm，4℃，5分钟去除培养基，加入2ml1×PBS缓冲液悬浮菌体，然后分装于2个1.5ml离心管中，10000rpm，离心2分钟，去上清，-20℃保存备用。操作步骤2：（大规模诱导-大量表达目标蛋白）5、取前面保存菌体（加入1×SDS上样缓冲液），沸水水浴5分钟（破细胞），室温冷却；6、在室温以10000rpm离心1分钟，取上清液10-20ulSDS-PAGE蛋白电泳检测。附：SDS-PAGE胶的制备及蛋白质电泳：12%分离胶配制(5ml):水1.6ml30%聚丙烯酰胺2ml1.5MTris-HCl(p

7、H8.8)1.3ml10%SDS0.05ml10%过硫酸铵0.05mlTEMED0.002ml制备SDS-PAGE胶分离胶配制时，过硫酸铵和TEMED先不加，将制胶板跟电泳槽装配好，制胶板凹面朝向自己方便注胶，然后加入过硫酸铵和TEMED，将胶液混合均匀后注入制胶板中，再加入一定量水饱和正丁醇去除气泡。放置30分钟，待胶完全凝固，去除正丁醇。然后配制积层胶。5%积层胶配制(2ml):水1.4ml30%聚丙烯酰胺0.33m