《原核表达实验》PPT课件.ppt

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1、实验一：大肠杆菌表达载体的构建及融合蛋白诱导表达生命科学技术学院2010年6月黑曲霉的优化培养总DNA或RNA的抽提PCR或RT-PCR扩增xynB基因目的基因的TA克隆质粒pMD-xylBEcoRI+XhoI双酶切凝胶回收试剂盒回收目的片断xynB乙醇沉淀回收线性化片断大肠杆菌表达载体pET-28(a)+酶连酶连产物转化E.coliDH5挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒(PCR及酶切验证)28S18S重组表达质粒转化E.coliBL21挑取重组子,用菌落PCR方法验证IPTG诱导促使目的大量蛋白表

2、达细胞破碎及蛋白抽提目标蛋白的纯化蛋白质浓度测定--Bradford法目标蛋白的鉴定—Westernbiotting融合蛋白诱导表达流程图XylBCK100mMIPTG1mlLB+Kan1-I1+I2+I3+ICk+I2-I3-ICk-I37℃,O/N37℃,2.7h37℃,2.7h37℃,O/N30℃,4h28℃,4h1mlLB+Kan3ul150ul3ul3ul3ul50mlLB+KanIPTG100mM使用浓度0.1mMKan100mg/ml使用浓度50μg/mlPBS缓冲液：137mMNaCl

3、2.7mMKCl10mMNa2HPO410mMKH2PO4试剂及缓冲液：3×SDS缓冲液：187.5mMTris-HCl(pH6.8,25℃)6%w/vSDS30%甘油0.03%w/v溴酚蓝GelStainingBuffer(每100ml):考马斯亮蓝250mg甲醇45ml乙酸10ml水45mlGelDestainingBuffer:甲醇100ml乙酸100ml加水至1000mlSDS-PAGE胶：30%聚丙烯酰胺10%SDS1.5MTris-HClpH8.80.5MTris-HClpH6.810%过

4、硫酸铵（现配）TEMEDTris-甘氨酸电泳缓冲液25mmol/LTris250mmol/L甘氨酸（电泳级）（PH8.3）0.1%SDS可配成5×贮存液备用，在900ml去离子水中溶解15.1gTris碱和94g甘氨酸，然后加入50ml10%（w/v）的电泳级SDA贮存液，用去离子水补至1000ml。操作步骤1：（小规模诱导-筛选正确表达克隆子）1、从平板上挑取1个pET28-xylB/BL21转化子接种于装有2mlLB/Kan（Kan浓度50ug/ml）培养基的PA瓶中，37oC，250rpm，培养

5、过夜；2、取过夜培养物按1%接种量分别转接二个装有2mlLB/Kan的PA瓶中，37℃培养约2小时40分钟；3、培养结束后，分别向其中一个瓶加入IPTG（终浓度0.1mM）并标记为“+I”，另一瓶不加IPTG标记为“-I”，28℃培养，250rpm，约4小时后收集菌体；4、从“+I”、“-I”培养瓶中各吸取1ml菌液于两个标有“+I”、“-I”的1.5ml离心管中,离心收集菌体,10000rpm、RT、1分钟，去上清，加入80ul缓冲液和40ul3×SDS上样缓冲液悬浮菌体，-20℃保存备用。5、取前

6、面保存菌体（加入1×SDS上样缓冲液），置沸水5分钟（破细胞），然后置室温；6、在室温以10000rpm离心1分钟，取上清10-20ulSDS-PAGE蛋白电泳检测。附：SDS-PAGE胶的制备及蛋白质电泳：12%分离胶配制(5ml):水1.6ml30%聚丙烯酰胺2ml1.5MTris-HCl(pH8.8)1.3ml10%SDS0.05ml10%过硫酸铵0.05mlTEMED0.002ml制备SDS-PAGE胶分离胶配制时，过硫酸铵和TEMED先不加，将制胶板跟电泳槽装配好，制胶板凹面朝向自己方便注胶

7、，然后加入过硫酸铵和TEMED，将胶液混合均匀后注入制胶板中，再加入一定量水饱和正丁醇去除气泡。放置30分钟，待胶完全凝固，去除正丁醇。然后配制积层胶。5%积层胶配制(2ml):水1.4ml30%聚丙烯酰胺0.33ml0.5MTris-HCl(pH6.8)0.25ml10%SDS0.02ml10%过硫酸铵0.02mlTEMED0.002ml积层胶制作方法跟分离胶制作相似，混合均匀后注入胶板，缓慢的插入梳子，静置30分钟，胶凝固后取出胶板，撕掉胶条，拔去梳子，再将胶板凹面背向自己装好电泳槽。缓慢向内槽倒

8、入Tris-甘氨酸电泳液，使其没过凹槽，向外槽倒入与内槽持平的电泳液。点样：所有的样品和蛋白Marker点样前都要沸水浴5分钟使蛋白质完全变性。一般的点样量为10-20ul。点样完毕后即可开始电泳，先以80伏电压跑15-20分钟，蛋白质通过积层胶后，更换到120伏，待溴酚蓝接近分离胶底部后停止电泳，取下胶板，小心撬开胶板割取分离胶，放入染色皿中，加入一定染色液（没过胶面即可）。置于摇床上染色30-45分钟。染色完毕后，回收染色液，加入脱色液，摇床脱色数次