camp反应元件萤光素酶报告基因载体的构建

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1、生技术通讯⋯58LETTTTERSINBIOTECHNOLOGYvol．·25)Nl。o．·1lJan．,2U⋯I4doi：10．3969~．issn．1009—0002．2014．01．014研究报告cAMP反应元件萤光素酶报告基因载体的构建马晓芸，于金梅，卓仁恭，张康，郑建全军事医学科学院毒物药物研究所，北京100850[摘要]目的：构建含有cAMP反应元件(CRE)的萤光素酶报告基因载体。方法：以含有gal4位点的萤光素酶报告基因质粒为模板，利用PCR方法，在去除gal4位点的同时，连入4个CRE元件得到pCRE—lu

2、c；将该载体与G蛋白偶联受体(GPCR)共转染人胚肾细胞HEK293，测定萤光素酶活性；应用蛋白激酶A(PKA)抑制剂确认CRE的活性是否与Gs通路相关。结果：pCRE—luc的活性直接相关于GPCR的激活程度，并依赖Gs信号通路。结论：CRE萤光素酶报告基因载体构建成功，可用于检测Gs偶联GPCR的活性，为基于GPCR的高通量药物筛选奠定了基础。[关键词]cAMP反应元件；报告基因；萤光素酶；G蛋白偶联受体[中图分类号]Q78；Q25[文献标识码]A[文章编号]1009—0002(2014)01—0058—04Constr

3、uctionofcAMPResponsiveElement—-ContainingLuciferaseRe-porterVectorsMAXiao—Yun，YUfin—Mei，ZHUORen—Gong，ZHANGKang，ZHENGJian—QuanBeijingInstituteofPharmacologyandToxicology，Beijing100850，ChinaCorrespondingauthor．E—mail：zhengjq@bmi．ac．cn[Abstract]Objective：Toconstructlu

4、ciferasereportervectorscontainingcAMPresponsiveelements(CRE)．Meth-ods：Usingaluciferasereporterplasmidincludinggal4sitesastemplate，weusedPCRtechniquetodeletethegal4sitesandtoadd4CREintotheoriginalplasmid．ThenthevectorpCRE—lucwasachieved．Next，tomea—sureitsluciferasea

5、ctivity，thevectorwascotransfectedwithaGproteincouplereceptor(GPCR)intohumanem—bryonickidney293(HEK293)cells．ToverifywhethertheactivityofCREwasassociatedwithGspathway，inhibi—torofproteinkinaseA(PKA)wasapplied．Results：TheactivityofpCRE—lucisdirectlyassociatedwiththea

6、cti—vatingdegreeofGPCR，anddependsontheGssignalpathway．Conclusion：TheCRElueiferasereportervector，whichcanbeusedtomeasuretheactivityofGsproteincoupledreceptors，wassuccessfullyconstructed．Ourre—searchwillprovidebasisforhigh—throughputscreeningdrugsrelatedtoGPCRtargets

7、．[Keywords]cAMPresponsiveelement；reportergene；luciferase；GproteincoupledreceptorG蛋白偶联受体(Gproteincoupledreceptor，的上市药物中有20％与GPCR相关。GPCR)是最大的膜受体超家族，目前发现的成员已通常情况下，GPCR激活后产生第二信使，而第超过1000个。该类受体具有7次跨膜螺旋结构，其二信使通过识别其位于基因启动子区的特异性反应功能与G蛋白偶联。G蛋白都由3个不同的亚单位元件改变下游基因的转录。目前发现的主要反应

8、元即仅、B和所组成，Ct亚单位具有特异的GTP结合位件有cAMP反应元件(CRE)、活化的核因子T细胞反点和GTP酶活性。根据G蛋白的亚单位结构，可将应元件(NFAT—RE)、血清反应元件(SRE)和激活蛋其分为Gs、Gi＼o、Gq＼l1和G12等4个亚家族。GPCR白一1(AP一1)等卅