动物微生物-病毒的鸡胚接种技术（实验四）

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1、一、原理鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低，病毒易于增殖，可选择不同的日龄和接种途径，感染病毒的组织和液体中含大量病毒。实验四鸡胚接种二、实验目的了解鸡胚的基本结构与功能，掌握常用的鸡胚接种方法。三、鸡胚的结构与功能卵壳壳膜气室绒毛尿囊膜尿囊腔羊膜与羊膜腔卵黄卵白卵壳膜气室绒毛尿囊膜羊膜腔尿囊腔卵白卵壳卵壳壳膜上有细孔，进行气体交换使气体分子和液体分子在内外两方面进行交换。气室绒毛尿囊膜呼吸和调节压力起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。尿囊腔胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿囊液中尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第1

2、2-13天后，尿囊液开始变得混浊。羊膜与羊膜腔卵黄卵白其中盛有羊水，胎体浸泡于其中在胚胎发育早期供给鸡胚营养。在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。四、材料1、鸡胚10日龄2、病毒鸡新城疫病毒（NDV）3、照蛋灯4、打孔器5、石蜡6、注射器7、蛋座8、酒精棉球、碘酊棉球五、受精卵的选择最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响受精卵的壳最好是白色的受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。六、孵育孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.5℃相对湿度：50%-60%必须保证有充分的新鲜空气流通，特别是在孵化5-6天以后从孵育后第3天开始，每天翻卵

3、一次。七、检卵自孵育后的第4天开始检卵，每天一次。孵育4-5日于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。未受精卵：只见模糊的卵黄阴影，不见血管和鸡胚痕迹活胚：具有清晰的血管和鸡胚暗影，较大鸡胚还可见到胚动，但孵育14、15天以后胚动不明显，甚至无胚动。死胚：血管昏暗模糊，没有胚动。八、接种前处理用检卵灯再次检查鸡胚活力，用铅笔画出气室和胚胎的位置，并在将要接种的部位做好记号。对鸡胚进行消毒。九、鸡胚用于病毒培养的优缺点（一）优点组织分化程度低，病毒易于增殖可选择不同的日龄和接种途径感染病毒的组织和液体中含大量病毒容易采集和处理来源充足设备和操作简便易行（二）缺点胚内可能污染细菌

4、和病毒沙门氏菌、禽白血病病毒、新城疫、禽脑脊髓炎病毒母源抗体许多病毒在鸡胚中增殖缺乏特异性的感染指针十、接种途径1、尿囊腔接种2、绒毛尿囊膜接种3、卵黄囊接种4、眼球接种5、羊膜腔接种正粘病毒和副粘病毒6、脑内接种狂犬病毒7、静脉接种蓝舌病毒（一）卵黄囊接种法主要用于虫媒披膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。方法一：1）取6-8日龄鸡胚，用检卵灯照视画出气室和胚胎位置后，垂直放置在卵座上(大头向上)2）用碘酊和酒精消毒气室端3）用钢锥在气室中央锥一小孔4）用注射器吸取病毒悬液，沿气室端所穿小孔垂直刺入3cm，注入0.1-0.5ml病毒液。5）用熔化的石蜡封孔，

5、置孵卵箱内继续孵育，每天翻卵1-2次，24h内死亡者废弃。4）用钢锥打一小孔，将针头刺入约1.5cm，注入病毒液0.1-0.5ml5）用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵育，24h内死亡者废弃方法二：1）2）同一3）将卵横放在卵座上，胚胎位置向下。在卵长径的1/2处用碘酊和酒精消毒。（二）绒毛尿囊膜接种主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。方法一：1）取10-12日龄鸡胚，画出气室部，消毒2）在气室端的卵壳上开一1.5×1.5cm的口3）用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜4）滴入接种物5）用胶布或透明胶纸封闭切口方法二：（要做人工气室）1、在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，

6、用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的烤焦圈。2、用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。3、在气室端中央钻一个小孔。4、用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜，滴加生理盐水于刺破处。5、用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。6、用1ml注射器滴2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。7、用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小孔用石蜡密封。8、胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。（三）尿囊腔接种主要用于正粘病毒和副粘病毒，如

7、流感病毒、新城疫病毒的分离和增殖。1、选用10-11日龄的鸡胚，画出气室和胚位2、在气室接近胚体处用碘酊和酒精进行消毒3、用钢锥穿一小孔4、将注射器沿小孔插入0.5-1.0cm，注入0.1-0.2ml接种物5、用石蜡封口，并置孵卵箱中孵育，每天翻卵并检卵一次，24h内死亡者废弃。十一、NDV接种鸡胚后对鸡胚的影响NDV以尿囊腔接种于9-10日龄鸡胚，强毒株在30-60h死亡，弱毒株3-6d死亡。死亡的鸡胚以尿囊液含毒量最高，胚胎全身出血，以头部、足趾、翅膀出血尤为明显。十二、收毒收毒前将鸡胚直立放置于4℃冰箱半小时