《蛋白质的分离纯化》PPT课件

《《蛋白质的分离纯化》PPT课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、基因工程下游技术简介1下游工艺的大体步骤细胞扩增细胞破碎离心分离（溶解包涵体）层析分离（离子交换层析反相层析疏水层析凝胶层析亲和层析等）2发酵工程主要指利用微生物、包括利用基因工程改造的微生物在全自动发酵罐或生物反应器中大量扩增的技术。现代发酵工程是生物代谢、微生物生长动力学、大型发酵罐或生物反应器研制、化工原理等密切结合和应用的结果。发酵工程（细胞扩增）34动物细胞培养细胞工程56单细胞藻类培养细胞工程一些单细胞低等植物如单细胞藻类的大规模培养成为细胞工程的重要组成部分获得蛋白质资源、营养食品、精细化工产品等等7分离纯化的要求1、纯度：

2、主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究蛋白质的一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。2、活性：要求保持天然构象状态，有高度的生物活性。3、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。8细胞破碎方法1.机械法：1)研磨：将样品置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆。2)组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常用10000r/min～20000r/min的内刀式组织

3、捣碎机(即高速分散器)将细胞打碎。92.物理法：1)反复冻融法：将细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。2)超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。103)压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。4)冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90℃左右维持数分

4、钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。11细胞器的分离细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网等，植物细胞还有叶绿体。如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防止其他细胞组分对制备物的干扰或污染，还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。12细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次分步离心后，即可获得所需组分。13粗分级分离主要是

5、利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开。优点：简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质。缺点：分辨率低，产品杂质多141.盐析（中性盐沉淀）在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。盐析法多用于蛋白质分离，已有八十多年的历史，其突出的优点是：①成本低，不需要特别昂贵的设备。②操作简单、安全。③对许多生物活性物质具有稳定作用。15⑴盐析的基本原理蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素为：水化膜和电荷。中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜

6、，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水溶胶，蛋白质分子聚集形成沉淀。16溶解度盐浓度Salting-outSalting-in17++++++++++++++++等点电时的蛋白质（亲水胶体）带负电荷蛋白质（亲水胶体）脱水脱水脱水带负电荷蛋白质（疏水胶体）不稳定蛋白颗粒阴离子阳离子碱酸酸蛋白质聚集沉淀带正电荷蛋白质（亲水胶体）碱++水化膜带正电荷蛋白质（疏水胶体）18⑵中性盐的选择常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：1)溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备

7、的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。由下表可以看到，硫酸铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类：19几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）0℃20℃80℃100℃（NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101硫酸铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类：202)分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。3)不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋

8、白质用2～3mol/L浓度的（NH4）2SO4保存可达数年之久。4)价格便宜，废液不污染环境。21（3）分段盐析不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚