《蛋白质分离纯化》PPT课件(I)

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1、基本操作玻璃仪器的洗涤需要清洗的玻璃仪器：试管、烧杯、比色盘、乳头吸管、层析柱等洗涤方法：自来水（＞7次）蒸馏水（＞3次）干燥备用清洁标准透明内壁不挂水珠外壁无字迹、标签加蒸馏水pH不变操作基本注意事项刻度吸管专管专用血清2ml一支PBS2ml一支(NH4)2SO42ml、0.5ml各一支实验前用蒸馏水清洗3次备用实验过程中：清水7次蒸馏水3次洗耳球不要被污染每次吸取液体液面不要过高视线要与观察刻度水平不要污染刻度吸管读数刻度吸管数据读取，视线要与液面保持平齐。蛋白质的分离纯化IsolationandPurificationofProtein实验目的掌握盐析、凝胶层析分离纯化蛋白质的基本

2、原理和操作步骤掌握离心机的操作熟悉蛋白质定性检测方法实验原理1盐析法23层析法离心技术4检测蛋白质、NH4+的方法盐析1[1]逐滴：边摇边缓慢滴入[2]混匀：盖子拧上在手心或桌上磕动不完全流出式刻度吸管：有“红色彩环”，当液体流出后，再停留15秒并转动。清洗刻度吸管：自来水7次蒸馏水3次注意不要污染洗耳球。盐析法定义：盐析是指溶液中加入大量中性无机盐以破坏蛋白质的稳定因素，而使蛋白溶解度降低并使之从溶液中沉淀析出的现象。原理：破坏蛋白质的稳定因素：水化膜、电荷层。中性盐：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl优点：蛋白质不变性1盐析法1影响因素：pH值：被分离的蛋白质在其等电点附近效果最

3、好盐的饱和度：盐的饱和度不同析出的蛋白质也不相同100%(NH4)2SO4：主要清蛋白沉淀50%(NH4)2SO4：主要球蛋白都沉淀33%(NH4)2SO4：主要γ-球蛋白沉淀温度要求不太严格：对温度敏感的蛋白质在低温（4℃）一般可在室温进行操作。蛋白质浓度：浓度过高时，常常出现共沉现象浓度过稀时回收率太低。因此盐析蛋白质含量25-30g/L。蛋白质分子颗粒大小和亲水程度不同相对分子质量和所带电荷不同盐析1[1]逐滴：边摇边缓慢滴入[2]混匀：盖子拧上在手心或桌上磕动[3]弃上清：直接倾倒（管口在滤纸上沾干净）[4]环壁：环绕离心管壁滴下清洗刻度吸管：自来水7次蒸馏水3次离心技术离心原理：利

4、用离心力将悬浮液中的悬浮颗粒快速沉降，借以分离比重（密度）不同的各种物质成分的方法。3离心技术离心机分类根据离心机的最大转速分类可以分为三类<5000rpm低速离心机5,000-25,000rpm高速离心机25,000-100,000rpm超速离心机3离心操作要领根据待离心的溶液性质和体积选择合适的离心管离心管连外套管一起平衡对称方向放入离心机中（转子对角线）当离心速度减为零时，方可打开离心机盖离心操作要领离心前一定要配平，配平后放入离心机转子对角线盐析1[1]逐滴：边摇边缓慢滴入[2]混匀：盖子拧上在手心或桌上磕动[3]弃上清：直接倾倒干净（管口在滤纸上沾干净）[4]环壁：环绕离心管壁滴下清

5、洗刻度吸管：自来水7次蒸馏水3次血液成分血浆（plasma）：将新鲜血液，经抗凝处理后，通过离心沉淀，所获得的不含细胞成分的液体（上层淡黄色清液）。人血清中几种主要蛋白质组分*血清蛋白质等电点分子量占蛋白质总量%清蛋白4.6469,00057～72α1-球蛋白5.06200,0002～5α2-球蛋白5.06300,0004～9β-球蛋白5.1290,000～150,0006.5～12γ-球蛋白6.85～7.3156,000～950,00012～20*醋酸纤维素膜电泳。γ-球蛋白是一类结构及功能相似的多种蛋白质。血清含量为0.7-1.5%。血清血清(serum）:指血液凝固后，析出淡黄色透明液

6、体。血清与血浆的区别：血清中没有纤维蛋白原等凝血因子层析法层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使其在随流动相流经固定相时，在固定相中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。脱盐常用透析法和凝胶过滤层析法。2透析法透析法的优点是透析后样品终体积较小、简便，但所需时间较长；透析法的缺点是最好低温进行，且盐不易除尽。凝胶层析法凝胶过滤法优点是整个处理过程非常“温和”，保护样品(如蛋白质、酶等)的生物活性，则是能将盐除尽，所需时间也明显缩短，但其凝胶过滤后样品终体积较大。凝胶层析法分子较大的物质先流出如γ-球蛋白，不可

7、进入凝胶颗粒内部，只沿凝胶颗粒外的间隙随流动相向下流动，受到的阻滞作用小，流程短，移动速度快，先流出。分子较小的物质后流出如(NH4)2SO4，可扩散渗透进入凝胶颗粒（网孔）内部，流程长，移动速度慢，后流出。层析类型：凝胶过滤层析法（gelfiltrationchromatography）固定相凝胶对不同组分因分子大小不同而受阻滞程度不同。离子交换层析法（ionexchangechromatogr