《超薄切片技术》PPT课件

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1、第四章超薄切片技术一、生物样品制备技术的重要性二、TEM样品制备技术分类四、超薄切片技术概述第一节基本概念三、扫描电镜样品制备技术一、生物样品制备技术的重要性1）电镜本身的分辨本领2）样品的结构和反差，而样品的结构与反差在很大程度又取决于样品制备技术1、决定电镜图像分辨率的两个因素2、电镜样品应具备的基本条件1）样品必须彻底干燥；2）样品要进行提高反差处理3）样品厚度要适宜4）样品耐受电子束的轰击5）充分保存好生物样品的超微结构二、TEM样品制备技术分类1、超薄切片技术（普通）2、冷冻超薄切片技术3、冷冻

2、置换和低温包埋技术4、金属投影技术5、表面复型技术6、冷冻(断裂)蚀刻及复型技术7、免疫电镜技术8、电镜细胞化学技术TEM，SEM共有9、电镜放射自显影技术1、表面镀金（喷镀）技术2、组织导电技术3、冷冻断裂技术4、离子蚀刻技术5、临界点干燥技术6、冷冻干燥技术7、铸型观察技术（复型）注：最基本、最经典的还是超薄切片技术SEM,TEM共有三、扫描电镜样品制备技术四、超薄切片技术概述1、超薄切片★样品厚度在10～100nm之间的切片为～石蜡切片h=10m(5~50m)超薄切片TEM专用，一般500～700

3、Å2、制作超薄切片的必要性1).增加电子透射能力2).电镜的场深大，切片太厚，上下结构重叠,使得图像不清楚3).减少色差4).减少样品对电子的吸收⑴细胞的细微结构保存良好，没有明显的物质凝聚、丢失、添加等人工效应⑵切片厚度500～700Å为宜,小于1000Å太薄：高，反差低太厚：低，反差好，结构重叠，电子甚至不能穿透⑶切片应耐电子束的强烈照射，不变形，升华⑷切片能够适当被染色，保证一定的反差⑸切片均匀，无皱褶、刀痕，无染色剂或其他化学物质的沉淀3、对超薄切片的要求取材→固定→脱水→渗透→包埋→聚合→修块

4、→切片→染色4、超薄切片制备的一般程序：第二节普通超薄切片技术一取材二固定三脱水四渗透与包埋五超薄切片六电子染色操作规则:快,小,冷,准,稳,轻(防损伤)⑴快：动作迅速,快取,投入固定液⑵小：样品体积小,动1mm3,植宽1，长3～4⑶冷：0～4℃⑷准：取的部位准，有代表性、目的性⑸轻：操作轻巧，避免拉、锯、压一、取材1、含义指从生物体上取下要观察的组织块。2、取材操作规则注意：由于水解酶的作用可引起细胞自溶⑴动物材料麻醉→解剖→戊二醛预固定（0～4℃，2％～5％）在预冷的玻板上细切（1mm3）→戊二醛前固定

5、(1～3h)→漂洗（10～30min）→1％锇酸后固定(1～2h)⑵植物材料叶片宽1，长3～4，有时需脱蜡根茎果实1mm3⑶单细胞：洗去有机成分→固定→预包埋→切块3、取材方法A、按样品类别分为：B、按取材地点分为：⑴野外取材：冰壶⑵实验室室内取材1、概念：用化学或物理方法迅速将细胞、组织杀死,同时把从细胞间的联系到细胞器的分子结构等全部组织的活体形态、精细结构及其组成真实的保存下来.2、常用的固定方法化学方法：锇酸（OsO4),戊二醛（C5H8O2),甲醛(HCHO)，高锰酸钾KMnO4、重铬酸钾、丙烯醛

6、物理方法：冷冻，干燥，高温二、固定（一）固定的基本知识⑴把细胞中的动态系统定格，要求生命过程立即停止,细胞和它周围组织中的半液体内含物立即凝固而不分解,接近细胞有机体的生活状态⑵防止以后的制备过程中丢失或添加成分⑶使其在电镜下有良好的电子反差3、固定的目的4、固定的标准细胞内膜结构线条清晰连续不断，细胞基质无明显溶泡和颗粒凝集1）组成：固定液：固定剂＋缓冲液2）作用：⑴破坏细胞的酶活性系统⑵稳定细胞物质成分，并保存之⑶接近细胞生活状态的渗透压,使细胞不收缩或膨胀⑷在组分的分子之间建立交联，提供骨架稳定细胞器

7、的空间构型⑸提供一定的电子反差5、固定液的作用1）渗透力强，穿透速度快，能迅速达到组织块的各部位，立即杀死细胞，以尽量减小死后变化2）稳定细胞成分和结构，使各种结构成分凝固或变性，以保证后续的各种处理中物质不溶解、不丢失3）使细胞不变形，保持各种结构生活时形状，不产生人工假象，以保证电镜图像的真实性。4)能保存一定的酶活性,以供细胞化学的测定5)最好提供一定的反差,并有防腐作用（二）常用的固定剂1、常用、理想固定剂应具备的条件优点：⑴几乎和细胞内所有成分发生化学结合⑵对氮具有较强亲和力，对含有蛋白质的细胞结

8、构固定作用良好⑶可保存脂肪,形成脂肪-锇复合物⑷Z=76，增加膜的反差⑸对磷脂蛋白、核蛋白保护很好2、理想固定剂1）锇酸（OsO4)锇酸缺点：⑴不能固定糖元、碳水化合物、核酸，对微管固定效果差⑵酶的钝化剂，不能用于细胞化学研究⑶分子量大,渗透能力差，要求组织块小⑷固定时间不宜过长⑸可与乙醇、醛类氧化还原反应生成沉积⑹有挥发性、剧毒2）戊二醛（C5H8O2）优点：⑴固定迅速，样品块可以大于1mm3⑵能保存糖元、蛋白