电镜超薄切片

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1、透射电子显微镜生物制品制备技术组织学与胚胎学教研室：苏衍萍冷冻蚀刻法超薄切片冷冻蚀刻法冷冻割断术细胞化学法免疫组织化学技术免疫电镜法电镜放射自显影术放射自显影技术扫描电镜技术被吞噬的红细胞现有的透射电镜生物制品制备技术分为两类：一类是透射电镜的基本制备技术，包括超薄切片和负染色法；另一类是生物制品的特殊技术，其中包括冷冻蚀刻法、冰冻割断术、细胞化学法、免疫电镜法、放射自显影技术、X线微区分析技术等。1、超薄切片样品的制备（1）取材基本要求是在活体情况下进行取材的原则(快、准、轻、小、冷的原则）1）快速：1

2、分钟之内投入固定液。2）块小：0.5-1mm3或截面1mm2的长条。3）部位准4）损伤小：器械应锐利，避免牵拉、挤压，防止组织受机械损伤。5）低温：0-4oC取材的方法1）动物材料：对神经组织等要进行原位固定或灌注固定，待组织适当硬化后再取材。胚胎干细胞的研究2）培养细胞：生长在瓶中的细胞到足够的量，先倒去培养液，然后倒入适量的戊二醛固定液，在冰浴下3-5分钟、弯头吸管吹打或用软器械轻轻地刮下贴壁的细胞，将这种混合液倒入离心管中，2000rpm低速离心15-20分钟，使细胞呈团，弃去上清液，换一次固定液，

3、将其移入修块台，修快成标准块4oC固定、待用。3）单细胞悬液：精子、血球等其他不易聚集的悬浮游离材料，可加入等量的戊二醛和其他类型的固定液，轻轻地把他们悬浮在固定液中。经过固定处理后再离心成团，在50oC中弃去上清液，加入适量的经50oC预温的2%的琼浆，使团悬浮，将悬浮团和琼脂液一同在薄片上展层，固定后切成1mm3的小块。（2）固定固定的目地是把细胞在活体状态时的结构尽可能完整的保存下来，避免自身酶的分解而出现自溶，或外界微生物的侵入而产生腐败，致细胞的超微结构破坏。1）固定液的作用A．阻止细胞自溶。B

4、稳定细胞物质成分。C在一些组分的分子之间以化学反应和物理反应建立铰链，提供一个骨架来稳定各种细胞的空间结构。D能提供一定的电子反差理想的固定剂，应具备以下条件：①能迅速而均匀地渗入组织细胞内部，稳定细胞内各种成分；②能即刻将细胞“杀死”，尽可能保持细胞微细结构，减少死后变化；③对细胞不产生收缩及膨胀作用，不产生人工假象及变形；④可保存酶的活性，以利于细胞化学测定工作的进行。2）影响固定效果的因素固定液的酸碱度(pH值)①固定液的pH值②渗透压③缓冲液的类型④固定的温度和时间当前采用的是在0～4℃下固定1～

5、4小时。3）常用的几种固定剂A四氧化锇（osmiumtetroxide,OsO4）亦称锇酸：锇酸实际上不是酸，它的水溶液是中性的，为一种强氧化剂。0.5-1g包装，淡黄色晶体。具有挥发性和毒性，在室温下易挥发，其蒸气对粘膜有刺激作用，在通风橱内径相配制。优点①对蛋白质和脂类固定较好。②对作为细胞骨架的磷酸脂蛋白的作用好，对核蛋白保护作用很好，因为在有机体内核酸和碳水化合物与蛋白制成复合的形式，因此锇酸几乎和所有的细胞成分结合。③分子密度高，产生良好的反差，因此锇酸固定本身也起到生物染色作用。缺点①不能固定

6、糖元和核酸，对微管固定较差。②扩散慢，穿透能力差。③具有挥发性和粘膜毒性。④不适于进行细胞化学工作。B戊二醛（glutaraldehyde,C5H8O2）纯的容易聚合，目前使用25%水溶液进口分装。存放时间久了容易变质，影响固定。优点(1)对组织穿透力强。(2)能保存某些酶的活性，对糖元、细胞膜、核基质等有较好的作用。(3)而且组织块在溶液中可保存较长的时间，适用于进行超微细胞化学研究。C甲醛（fomaldehyde）:多用多聚甲醛粉剂配制。其分子小，渗透力强，固定迅速，对酶的活性保存好。2）固定的方法A

7、单固定法：对单细胞或固定液易于浸透的组织，一般单独用1-2%四氧化锇固定液固定1-2小时可达到固定的目地。B双固定法：戊二醛（2.5%4oC2h）---锇酸（1%4oC2h）。C原位固定和灌注固定：将动物麻醉、解剖进行原位固定。灌注固定：通过血液循环将醛类的固定液灌流到所需组织中。神经组织、视网膜、肾脏。附几种常见固定剂的配制固定液的PH值6.0-8.0，常用PH值7.2-7.4,对含水较多的组织可用PH值8.0，细菌、病毒可用PH值在7.0以下。0.2mol/L磷酸缓冲液的配制磷酸二氢钠（NaH2PO4

8、.H2O）2.6g磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）29g重蒸水加到500ml调PH到7.40.2mol/L二甲坤酸盐酸缓冲液重蒸水25ml二甲坤酸钠（Na(CH3)2AsO2.3H2O）2.14g0.1mol/L盐酸8ml重蒸水加至50ml调PH到7.4B固定液的配制锇酸固定液的配制2%的锇酸固定液的配制：清洗烘干器皿--1G锇酸+50ml双蒸水（棕色瓶）数日可用。0.1mol/L磷酸盐缓冲液或二甲坤酸盐缓冲液配制的1