环介导等温扩增技术快速检测牛乳腺炎病原菌方法的建立

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1、分类号：S813.3单位代码：10183研究生学号：2016884008密级：公开吉林大学硕士学位论文（专业学位）环介导等温扩增技术快速检测牛乳腺炎病原菌方法的建立DevelopmentofaMethodfortheRapidDetectionofBovineMastitisPathogensBasedonLoop-mediatedIsothermalAmplification作者姓名：樊荣类别：农业硕士领域（方向）：养殖指导教师：李纯锦教授培养单位：动物科学学院2018年12月环介导等温扩增技术快速检测牛乳腺炎病原菌方法的建立DevelopmentofaM

2、ethodfortheRapidDetectionofBovineMastitisPathogensBasedonLoop-mediatedIsothermalAmplification作者姓名：樊荣领域（方向）：养殖指导教师：李纯锦教授类别：农业硕士答辩日期：2018年12月5日未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学硕士学位论文原创

3、性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研宄工作所取得的成果。除文中已经注明弓用的内容外，ｆ本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：Ｈ日期：年ｈ月右日本课题受以下项目资助吉林省科技攻关重点项目（20170204039NY）吉林省省校共建项目（SXGJXX2017-11）国家重点研发计划项目（2016YFD0500503）中文摘要环介导等温扩增技术快速检测牛乳

4、腺炎病原菌方法的建立乳腺炎是影响奶牛生产的主要疾病之一。快速准确鉴定出引起奶牛乳腺炎发病的主要病原体，对奶牛乳腺炎的防治、患病牛只的隔离治疗、净化牛群以及保证牛群健康生产具有十分重要的意义。但在生产实践中，受到仪器设备、人员水平和养殖区域等现实条件制约，现有奶牛乳腺炎检测技术显的相对滞后。常规培养基检测病原的方法繁琐费时，而且经常出现假阳性结果。而利用PCR方法检测某一病原体的方法对操作人员水平和设备要求较高、不便在一线养殖中全面推广。因此，开发快速、特异、灵敏、便捷、经济适用的奶牛乳腺炎病原菌检测方法具有重要的应用推广价值和市场需求。环介导等温扩增技术(L

5、oop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一种新型等温核酸扩增技术，因其检测的特异性好、灵敏度高、耗时短、可操作性强等多种优点，近些年该技术已广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等多种病原生物的检测中，在人、畜等的病原物检测及疾病的早期诊断等领域有着十分广阔的应用前景。本研究通过技术优化和方案改进，建立了基于LAMP检测奶牛乳腺炎主要致病菌的方法。主要内容包括：（1）结合盐酸胍裂解液和核酸提取柱，建立了从牛奶中快速提取总DNA的方法。该方法能在10分钟内快速提取高纯度的奶样总DNA，完全可以满足后续各种分子检测的需要。（2）

6、通过优化LAMP反应体系，建立了快速检测奶样中7种乳腺炎致病菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、肺炎克雷伯氏菌、白色念珠菌、肠球菌和支原体）的检测技术。同时根据引起奶牛乳腺炎发病的常见菌种，建立了金黄色葡萄球菌-链球菌的多重LAMP检测方法。通过实验比较发现，该技术检测结果与常规PCR技术检测结果一致，说明该方法的准确性和稳定性能够满足生产一线的需求并且节省了时间和成本。（3）基于LAMP技术构建了奶牛乳腺炎快速检测试剂盒并对其进行了效果测试。结果表明此诊断试剂盒可以快速准确地检测出奶牛乳腺炎I7种常见致病菌，说明该试剂盒适合于奶牛养殖场的大批量检测，对奶

7、牛乳腺炎的早期诊断和及时精准治疗具有较高的潜在应用价值。关键词：奶牛，乳腺炎，病原菌，DNA提取，环介导等温扩增技术，试剂盒IIABSTRACTDevelopmentofaMethodfortheRapidDetectionofBovineMastitisPathogensBasedonLoop-mediatedIsothermalAmplificationMastitisisoneofthemostcostlyandfrequentdiseasesofthedairycowsthroughouttheworld,thereforeitcausesthegr

8、eatesteconomiclossesindair