PEDV分子流行病学调查及其调控细胞因子的研究

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1、学校代码：10564学号：2016307444分类号：S855.3密级：硕士学位论文PEDV分子流行病学调查及其调控细胞因子的研究王艳午第一指导教师：宋长绪研究员第二指导教师：张胜勋高级兽医师学院名称：动物科学学院专业学位类别：农业硕士领域：养殖答辩委员会主席：刘德武中国·广州2018年6月III摘要猪流行性腹泻（Porcineepidemicdiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）感染猪引起的严重接触性传染疾病，其临床症状主要表现为感染猪群食欲

2、不振，哺乳仔猪呕吐，水样腹泻，脱水死亡。近年来，PEDV发病率逐年增高，给养殖业带来了巨大的经济损失。为了解中国内地的PEDV流行情况，筛选合适的PEDV疫苗，本研究对2016~2017年采集的来自国内疑似腹泻样品共37份，利用RT-PCR对37份疑似样品进行PEDV抗原检测，其中32份为PEDV阳性病料。通过RT-PCR方法扩增毒株的S基因片段序列、M基因序列及ORF3基因序列，并与国内外GenBank发布的PEDV毒株序列做比较，对中国内地PEDV流行毒株进行遗传进化分析，比较核苷酸和氨基酸序列同源性及氨基酸序列变异

3、情况。S基因片段遗传进化分析表明，本研究检测的32株PEDV毒株中有26株与变异毒株CH/JXJA/2017和AJ1102处于同一分支；S基因核苷酸序列同源性分析表明，本研究所测毒株之间的核苷酸序列同源性为85.9%～100%，与韩国毒株VirulentDR13、越南毒株VAP1113-1、美国毒株OH851和欧洲毒株CV777等参考毒株的核苷酸序列同源性为85.2%～98.1%；对S基因片段编码的氨基酸序列同源性分析表明，本研究所测毒株之间的氨基酸序列同源性为81.1%～100%，与参考毒株的同源性为79.2%～97.

4、2%；本研究所测毒株的S基因编码的氨基酸序列有部分氨基酸位点的插入和缺失，且氨基酸位点的突变较多。M基因的遗传进化分析表明，本研究所测毒株之间的核苷酸序列同源性为97.1%～100%；与韩国毒株VirulentDR13、越南毒株VAP1113-1、美国毒株OH851和欧洲毒株CV777等参考毒株的同源性为96.0%～100%；对M蛋白氨基酸序列同源性分析比较，本研究所测毒株之间的氨基酸序列同源性为96.5～100%，与参考毒株的同源性为95.2%～97.2%；M基因编码膜结构蛋白，氨基酸序列较为保守，少数毒株在其中4个氨

5、基酸位点发生突变，部分毒株氨基酸位点存在缺失。对所检测到的32株PEDV毒株的ORF3基因进行遗传进化分析发现，所测毒株之间的核苷酸序列同源性为89.3%～100%，与参考毒株的同源性为59.7%～100%；本研究所测毒株之间的氨基酸序列同源性为89.8%～100%，与参考毒株氨基酸的同源性为59.6%～100%，6处氨基酸位点存在明显突变，其它少数位点存在少量氨基酸突变。近年来PEDV给养殖业带来了巨大的经济损失，PEDV感染机体的致病机制一III直是困扰人们的问题，本研究初步探讨了PEDV感染细胞调控细胞因子的机制，

6、结果表明PEDV感染细胞后能够上调Vero细胞中趋化因子CCL2、CXCL10和IL8以及促炎因子IL6和肿瘤坏死因子TNFα的表达量；研究显示PEDV的nsp4蛋白通过激活NK-κΒ信号通路，进而引起这些细胞因子表达量的上调。通过siRNA干扰试验下调Vero细胞中CCL2、CXCL10、IL8、IL6和TNFα的表达量，利用荧光定量PCR方法检测细胞中的PEDV病毒载量，结果显示下调细胞因子CCL2、CXCL10、IL8、IL6和TNFα的表达量有利于PEDV复制。通过在VeroE6细胞中过表达CCL2、CXCL10

7、、IL8、IL6和TNFα，利用荧光定量PCR方法测定细胞中PEDV病毒载量，结果显示CCL2、CXCL10、IL8、IL6和TNFα的过表达抑制PEDV的复制。本研究表明中国内地PEDV流行毒株以变异毒株为主，且大部分毒株的S基因存在较多核苷酸位点的插入和缺失，少量毒株的ORF3基因存在核苷酸位点缺失，M基因较为保守。PCMV-PEDV-nsp4通过激活NF-κΒ信号通路促进Vero细胞中趋化因子CCL2、CXCL10和IL8以及促炎因子IL6和肿瘤坏死因子TNFα的表达量的上调，抑制病毒复制，这些结论为PEDV防控和

8、阐明PEDV致病机制提供了理论基础。关键词：猪流行性腹泻病毒；遗传进化分析；细胞因子；信号通路IVMolecularlyepidemiologicalinvestigationofporcineepidemicdiarrheavirusinchinaandStudyoncytokineregulationmechan