海生红藻多管藻R-藻蓝蛋白分离纯化及结构特性分析

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1、分类号：P735学号：201500370015硕士学位论文海生红藻多管藻R-藻蓝蛋白分离纯化及结构特性分析Theisolation,purificationandcharacteristicanalysisofR-phycocyaninfromPolysiphoniaurceolataGrev研究生姓名：王胜楠指导教师：孙力教授学科门类：理学专业名称：生物学论文提交日期：2018年4月1日I摘要本实验选用从烟台海滨采集的新鲜海生大型红藻多管藻(Polysiphoniaurceolata-1Grev)为研究材料，用50mmo1·L的磷酸缓冲液(PBS

2、)浸取藻胆蛋白，提取液经过滤离心后用500kDa的膜包超滤，超滤后的透过液用50kDa的膜包进行截留浓缩。藻胆蛋白浓缩液依次经SephacrylS-300和SephacrylS-200凝胶过滤，得到在618nm和650nm有特征吸收峰的R-PC/AP组分。R-PC/AP组分先经过QSepharoseFastFlow-1-1离子交换层析，NaCl浓度梯度(50~250mmo1·L，150~350mmo1·L)洗脱，并在洗脱过程中加入7.5~6.5的pH梯度，分别收集R-PC和AP组分。再选用PhenylSepharose6FastFlow疏水层析分别

3、纯化离子交换得到的R-PC和AP组分，PBS浓度梯度-1(400~10mmo1·L)洗脱收集R-PC、AP、R-PC2。建立了同时制备多管藻两种藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的多维层析方法。收集到的R-PC组分在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示单一条带，R-PC2组分含少量藻红蛋白。经非变性等电聚焦测定，R-PC的等电点为5.63，R-PC2的等电点为5.62；R-PC和R-PC2在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析观察到均有含一种α亚基和两种β亚基，分子质量分别为18.3kDa、20.5kDa和21.4kDa，但是β亚基的相对含量不同，不含无色多肽，变性等点聚焦测得

4、R-PC的两个β亚基的等电点分别为5.8和5.74；R-PC2两个β亚基的等电点分别为5.8和5.75。经二维电泳确定R-PCβ8.58.5.574.574有四个β亚基分别为、β、β、β。214.205.214.205.关键词：多管藻；R-藻蓝蛋白；离子交换；疏水层析；凝胶电泳IIAbstractPhycobiliproteinwasextractedfromthefreshPolysiphoniaurceolataGrevin50-1mmo1·Lphosphatebuffer,pH7.0.Afterthephycobiliproteinswere

5、ultrafiltratedwith500kDaand50kDamembranecapsules,respectively.TheconcentratedphycobiliproteinconcentratewasisolatedbygelfiltrationusingSephacrylS-300andSephacrylS-200togiveR-PC/APfractionswithcharacteristicabsorptionpeaksat618nmand650nm.R-PC/APfractionswereisolatedbyQSepharose

6、FastFlowionexchangechromatographywithNaClsaltconcentrationgradientelution.ThepHgradientof7.5~6.5isaddedtotheelutionprocess.TheR-PCandAPfractionswerecollectedrespectively.Afterthat,theR-PCandAPfractionsobtainedbyionexchangechromatographywerepurifiedbyPhenylSepharose6FastFlowhyd

7、rophobicchromatography.ThecolumnwaselutedwiththeconcentrationgradientofPBSsaltconcentrationandtheR-PC,R-PC2andAPfractionswerecollected.TheR-PCfractionobtainedbythechromatographydisplaysinglebandinnativepolyacrylamidegelelectrophoresis.Theresultsofnativepolyacrylamidegelelectro

8、phoresisshowedthattheR-PC2fractioncontainedasmallamountofR-PE