实验：猪胰蛋白酶的分离纯 化

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1、《生化工程》课程实验猪胰蛋白酶的分离纯化与检测主要内容实验内容实验目的实验原理实验方法实验结果实验报告格式实验内容一、猪胰蛋白酶的分离纯化二、蛋白质含量的测定三、酶活力的测定四、纯化效果检测——SDS-PAGE电泳检测实验目的1、掌握盐析沉淀法、透析法及离子交换层析的原理和操作过程；2、熟悉胰蛋白酶分离纯化的一般过程；3、掌握胰蛋白酶活力测定方法及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。实验原理一、胰蛋白酶的基本特性二、本实验采用的分离纯化方法的原理1.沉淀法2.透析法3.离子交换层析技术三、胰蛋白酶活性测定原理实验原理一、胰蛋白酶的基

2、本特性胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。猪胰蛋白酶的分子量约为23.4kDa，其等电点约为pI=10.8，最适pH7.6～8.0，胰蛋白酶在pH=3左右较稳定，Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用，在低温条件下贮存数周内酶的活性不发生明显的改变。LysValAspAspAspAspGlyIleLysValAspAspAspAspValHisSerSSSS46183

3、GlyIleValHisSerSSSSEnteropeptidase肠激酶Trypsin胰蛋白酶ActivesiteTheprocessoftrypsinogenactivation胰蛋白酶原激活过程实验原理二、本实验采用的分离纯化方法的原理盐析沉淀法：用硫酸铵盐析法将目的蛋白从粗提液中沉淀出来，使其得到浓缩，并除去部分杂质（核酸、杂蛋白等）。1.沉淀法实验原理二、本实验采用的分离纯化方法的原理由于膜两侧的溶质浓度不同，在浓度差的作用下，高分子溶液（如蛋白溶液）中的小分子溶质（如无机盐）透向透析液一侧，同时透析液中的缓冲液渗入蛋白

4、溶液一侧，经过透析液反复换液后，即可达到脱盐和置换缓冲液的目的。1.透析法实验原理二、本实验采用的分离纯化方法的原理同类型的带电离子间可自由地相互交换和竞争结合。蛋白质在其等电点以下（pHpI），带负电荷，可被阴离子交换树脂所吸附。本实验中的猪胰蛋白酶等电点为pI=10.8，在pH=5.0的缓冲液中猪胰蛋白酶带正电荷，可被阳离子交换树脂所吸附（本实验采用CM-纤维素离子交换树脂）；而带负电荷的杂蛋白不被吸附而除去，带正电荷的杂蛋白也被吸附，但不同蛋白与树脂

5、的吸附能力不同，通过增加缓冲液中的离子强度及提高pH，可将蛋白从树脂上洗脱下来。在不同的离子强度下，可将不同的蛋白分别洗脱（结合力弱的蛋白最先洗脱，结合力强的蛋白最后洗脱）。通过以上离子交换层析法，即可将目的蛋白和杂蛋白分开，从而得到纯化。3.离子交换层析法实验原理三、胰蛋白酶活性测定原理胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所组成的肽键具有专一性。特别表现在对碱性氨基酸羧基一侧的选择性。本实验以酪蛋白为底物的方法来测定胰蛋白酶活力，其主要用于测定胰蛋白酶粗制品的活力。胰蛋白酶催化

6、水解底物酪蛋白生成不被三氯乙酸沉淀的小分子肽以及氨基酸。在一定浓度范围内酶的水解滤液在波长280nm处光吸收的增值与胰蛋白酶的活力单位成正比。活力单位的定义：在一定条件下每分钟酶水解底物酪蛋白形成的溶液在280nm处吸光度A280增加一个单位的酶量为一个蛋白酶活力单位（U）。实验方法一、猪胰蛋白酶的分离纯化二、蛋白质含量的测定三、酶活力的测定四、纯化效果测定——SDS-PAGE电泳检测实验方法一、猪胰蛋白酶的分离纯化（1）粗猪胰蛋白酶的提取（2）透析（3）离子交换层析法纯化猪胰蛋白酶实验具体操作参见《实验指导》实验方法一、猪胰蛋白

7、酶的分离纯化①猪胰脏去脂肪和结缔组织，切碎，称重约50g→加入5倍体积预冷的pH2.5乙酸酸化水②组织捣碎③提取、过滤（四层纱布）、离心（4℃下，10000rpm，离心15min）——取上清（记录体积，收集约1.5mL，作为留样1，测蛋白含量，及时SDS化）④加入固体无水氯化钙粉末为猪胰蛋白酶原的激活提供Ca2+（含有0.1mol/LCaCl2）——需计算CaCl2的用量。⑤加入极少量猪胰蛋白酶（约2-5mg）调pH为8.0、于25℃下活化4~6小时，（1小时取样一次，并用0.001mol/LHCl稀释），测定酶活性增加的情况；比

8、活约3500～4000单位时，活化完成。用2.5mol/LH2SO4调pH至2.5～3.0(收集约1.5mL，作为留样2，测蛋白含量，及时SDS化)⑤硫酸铵盐析沉淀（75%饱和度）——计算硫酸铵用量时需扣除形成硫酸钙的量。（于4℃静置过夜）⑥离心（