刺糖多孢菌中SsbR蛋白的计算机模拟及功能验证

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1、ComputerSimulationofSsbRProteininSaccharopolysporaspinosaanditsFunctionalVerificationADissertationSubmittedfortheDegreeofMasterCandidate：WuHengyuanSupervisor：Prof.XiongJianSouthChinaUniversityofTechnologyGuangzhou,China分类号：S-3学校代号：10561学号：201520120852华南理工大学硕士学位论文刺糖多孢菌中SsbR蛋白的计算机

2、模拟及功能验证作者姓名：吴恒源指导教师姓名、职称：熊犍教授申请学位级别：硕士学科专业名称：食品科学与工程研究方向：微生物论文提交日期：2018年04月20日论文答辩日期：2018年05月26日学位授予单位：华南理工大学学位授予日期：年月日答辩委员会成员：夏枫耿、熊犍、陈中、黄立新、胡飞主席：夏枫耿委员：熊犍、陈中、黄立新、胡飞摘要刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)是一种重要的工业放线菌，其产生的次级代谢产物多杀菌素(spinosad)是一种高效、广谱和安全的生物杀虫剂。为了更有效地对刺糖多孢菌进行基因改造以提高其多杀菌素产量

3、，需对刺糖多孢菌次级代谢调控机制进行深入研究。级联调控是放线菌进行次级代谢调控的重要方式。本研究主要对刺糖多孢菌中级联调控关键同源蛋白SsbR(Saccharopolysporaspinosaγ-butyrolactoneReceptor)进行计算机模拟及功能验证：1、通过NCBI上的ProteinBlast工具在刺糖多孢菌的基因组进行查寻，找到级联调控关键同源蛋白SsbR，及其靶标同源蛋白SstA1、SstA2、SstA3和下游8个效应同源蛋白。并对SsbR蛋白进行计算机模拟分析。2、通过荧光定量PCR技术对ssbR基因、sstAs基因及效应蛋白同源

4、基因在发酵过程中的表达水平进行分析，发现ssbR基因与sstAs基因表达水平变化趋势相反，符合SsbR蛋白对sstAs基因进行阻遏调控的预测。3、通过凝胶阻滞实验(EMSA)发现SsbR蛋白可与sstA2基因启动子序列胞外结合，进一步验证了SsbR蛋白对sstA2基因的阻遏调控功能。4、通过同源双交换的方法成功获得ssbR基因缺失突变菌株。其多杀菌素产量较出发菌株提高26.9%，揭示SsbR蛋白在刺糖多孢菌中对多杀菌素合成有负调控功能。5、以ssbR基因缺失突变菌株发酵获得多杀菌素，研制多杀菌素水分散粒剂并进行大棚实验。结果表明，该制剂具有良好的杀虫药

5、效。关键词：刺糖多孢菌；计算机模拟；SsbR蛋白；功能验证IABSTRACTSaccharopolysporaspinosaisanimportantindustrialmicroorganismknownforspinosadproduction,whichisakindofbiologicalinsecticideswithhighefficiency,broadspectrumandlowtoxicity.Inordertoimprovetheyieldofspinosad,itisnecessarytogaininsightintothereg

6、ulatorymechanismsandnetworksofspinosadbiosynthesisinS.spinosa.Cascaderegulationisanimportantwayforactinomycetestoregulatesecondarymetabolism.ThisstudymainlyperformedcomputersimulationandfunctionalverificationofcascaderegulationkeyhomologousproteinsSsbR(Saccharopolysporaspinosaγ-

7、butyrolactoneReceptor)inS.spinosa：1、ThecascaderegulationkeyhomologousproteinsSsbR,anditstargethomologousproteinsSstA1,SstA2,andSstA3,eightdownstreameffectorhomologousproteinswerefoundinS.spinosa.AndcomputersimulationanalysiswastakenonSsbRprotein.2、QRT-PCRanalysisoftheexpressionl

8、evelsofssbRgene,sstAsgenesandeffectorhomologues