透明颤菌血红蛋白基因在刺糖多孢菌中整合表达促进多杀菌素的生物合成.pdf

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1、中国科学：生命科学2012年第42卷第2期：148—157《中国科学》杂志社SClENTIASINICAVitae、『I，ww．scichina．comIife．scichina．comSCIENCECHINAPRESS透明颤茵血红蛋白基因在刺糖多孢菌中整合表达促进多杀菌素的生物合成罗玉双卞，寇笑笑，丁学知，胡胜标，唐滢，李文萍，黄蹯，杨琦，陈汉娜，夏立秋湖南师范大学生命科学学院，微生物分子生物学国家重点实验室培育基地，长沙410081十同等贡献联系人，Email：xialq@hunnu．edu．cn收稿日期：2011-11-18；接受日期：20

2、12一O1O6国家重点基础研究发展计划(批准号：2012CB722301，2011CB111605)、国家高技术研究发展计划(批准号：2011AA10A203)~国家自然科学基金(批准号：31070006)资助项目摘要为解决刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)高密度深层培养过程中的供氧不关键词刺糖多孢菌足问题，促进多杀菌素的生物合成，采用重叠PCR技术将透明颤菌(Vitreoscilla多杀菌素stercoraria)血红蛋白基(vgb)读框(0RF)置于红霉素抗性基因启动子(之下，并将透明颤菌血红蛋白其克隆到整合型载体

3、pSET152上，构建成vgb表达载体pSET152EVHB；通过接合转移方整合型载体式将其导入刺糖多孢菌SP06081中，利用载体上OC31整合性位点通过位点特异性重组将同源重组vgb定点整合到SP06081菌株染色体上，获得一株遗传性能稳定的重组菌株S078．1101；重组工程菌的PCR与Southernblotting检测显示vgb已整合到染色体上，一氧化碳结合差光谱分析表明在S078—1101工程菌中表达了有活性的透明颤菌血红蛋白(VHb)；摇瓶发酵结果显示，在正常溶氧与中度限氧状态下，vgb的表达均可显著促进多杀菌素的生物合成(P<0．

4、01)．这说明vgb在刺糖多孢菌中的整合表达改善了菌体对溶氧的吸收性能，是一种有效的定向遗传改良手段．透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscillahemoglobin红蛋白相似，在不同的溶氧条件下可在氧化态、还原gene，vgb)来源于专性好氧的丝状革兰氏阴性菌透明态和氧合态3种状态之间相互转化f2；超微结构研究颤菌(Vitreoscillastercoraria)的基因组，在贫氧条件显示，VHb主要分布于细胞质中并聚集在细胞膜附下能被大量诱导合成一种可溶性血红蛋白一透明颤近[31；早期的作用机理研究表明，VHb通过与细胞色菌血红蛋白(Vitr

5、eoscillahemoglobin，VHb)，以满足菌素幻末端氧化酶相互作用来提高电子传递链的周转体对溶氧的需求．VHb最初被认为是具有末端氧化酶率，在氧限制条件下能捕捉分子氧，并协助其转移到性质的“细胞色素D”(cytochromeO，Cyo)]．光谱学分生命力旺盛的呼吸膜上，使细胞适应贫氧的生活环析表明，VHb在氧结合动力学性质上与氧合肌红、血境_4；近年VHb相关的代谢调控与蛋白质组研究显英文版见：LuoYS，KouXX，DingXZ，eta1．Promotionofspinosadbiosynthesisbychromosomalint

6、egrationoftheVitreoscillahemoglobingeneinSaccharopolysporaspinosa．SciChinaLifeSci，2012，55，inpress中国科学：生命科学2012年第42卷第2期示，它还具有过氧化物酶活性l5】，其表达能调节菌体1材料与方法的生理功能，消除发酵过程中有机酸等副产物对菌体的影响【6’‘，并对能量代谢、中心中间体代谢等有调1．1菌株、质粒与引物控作用f8}9]．VHb已被广泛应用于易受氧限制的微生本研究所用菌株、质粒与引物见表1物高密度发酵生产过程ll0'¨】，其最新的应用研究

7、包1．2培养基与培养条件括：促进二羟基丙酮(dihydroxyacetone，DHA)等生化药物原料与前体物质的生产[12-151；改善生物修复功大肠杆菌fEcoliDH5ct)采用Luria—Bertani(LB)或能，如：加强红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)TY液体培养基【3”．接种单克隆或l％菌种保藏液于的生物脱硫作用_】刮；提高D一氨基酸氧化酶(D．amino10mL含相应抗生素的LB培养基中，37。C，200r／minacidoxidase)等重要酶的合成[1，：促进抗生素及摇瓶培养过夜；刺糖多孢菌种子活化培

8、养基采用生物杀虫剂生物合成n9_。；增强聚’，谷氨酸CSM(TrypticSoyBroth30g／L，酵母提取物3g／L，葡(poly吖