人BCCIP蛋白表达纯化与过表达细胞系构建

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1、分类号：Q7单位代码：10183研究生学号：2015342003密级：公开吉林大学硕士学位论文（理学硕士）人BCCIP蛋白表达纯化与过表达细胞系构建HumanBCCIPproteinexpressionandpurificationandoverexpressionofcelllineconstruction作者姓名：李富强专业：微生物学研究方向：表观遗传学指导教师：金景姬教授培养单位：生命科学学院2018年6月人BCCIP蛋白表达纯化与过表达细胞系构建HumanBCCIPproteinexpressionandpurificat

2、ionandoverexpressionofcelllineconstruction作者姓名：李富强专业名称：微生物学指导教师：金景姬教授学位类别：理学硕士答辩日期：2018年5月29日未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学硕士学位论文原创性声明？，本人郑重声明．所呈交学位论文，，是本人在指导教师的

3、指导下独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研宄做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：ｇ曰期：州ｓ年／月：Ｔ曰摘要人BCCIP蛋白表达纯化与过表达细胞系构建BCCIP是一个与p21和乳腺癌易感基因2相互作用的蛋白质。本研究论文采用大肠杆菌融合型表达系统，表达纯化BCCIP蛋白并免疫小鼠制备BCCIP抗体。并且以乳腺癌细胞MCF-7为研究对象，构建可诱

4、导过表达BCCIP的稳转细胞系。过表达BCCIP细胞通过PCR、WesternBlot方法验证其诱导表达情况，并研究过表达BCCIP对乳腺癌细胞生长增殖的影响。实验结果：1.BCCIP蛋白表达纯化（1）构建了pGEX-6P-1-BCCIPα、β重组质粒；（2）诱导表达GST-BCCIPα、GST-BCCIPβ重组蛋白，确定了最适诱导表达条件；（3）分离纯化出纯度较高的GST-BCCIPα、GST-BCCIPβ重组蛋白，PreScissionProtease酶切获得大量BCCIPα和BCCIPβ蛋白；（4）BCCIP蛋白免疫小鼠制备

5、BCCIP抗体,并用HCT116、Hela、293T细胞蛋白样品验证了BCCIP抗体的效价和特异性；2.MCF-7Teton细胞系构建及验证（1）在MCF-7细胞系中确定了G418的有效浓度，为后续实验提供基础；（2）验证了四环素可诱导表达系统适用于乳腺癌细胞MCF-7；（3）在MCF-7细胞中瞬转pTeton质粒，G418成功筛选出MCF-7Teton稳转细胞系；3.过表达BCCIP乳腺癌细胞系构建及验证（1）成功构建pTRE2-puro-myc-BCCIPα和pTRE2-puro-myc-BCCIPβ重组质粒；（2）MCF-7

6、Teton稳转细胞的基础上成功筛选出可诱导表达BCCIP蛋白的稳转细胞系；（3）对可诱导表达BCCIPα和BCCIPβ的细胞克隆进行验证，成功筛选出诱导效果明显的细胞系；（4）利用MCF-7BCCIPαTeton2号细胞克隆确定了dox最低有效诱导蛋白表I达浓度为2ug/ml,最适诱导时间为48小时；（5）诱导表达BCCIPα和BCCIPβ细胞数显著少于对照组，说明BCCIP抑制MCF-7细胞生长增殖；结论：1.构建了原核表达载体pGEX-6P-1-BCCIPα/β，在原核生物大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白GST-B

7、CCIPα/β，PreScissionProtease酶切获得大量BCCIPα和BCCIPβ蛋白，并成功制备BCCIP抗体；2.在MCF-7细胞中构建过表达BCCIP细胞系，发现dox诱导BCCIP高表达时能有效抑制细胞生长增殖，证明BCCIP能抑制乳腺癌细胞生长。关键词：BCCIP，过表达细胞系，蛋白纯化，诱导表达,TetonIIAbstractHumanBCCIPproteinexpressionandpurificationandoverexpressionofcelllineconstructionWaf1/Cip1The

8、BCCIPproteinisaBRCA2andCDKN1A(p21)Interactingprotein,whichbindstoahighlyconserveddomianofBRCA2,andaC-terminaldomainofthep21.