受hTERT启动子调控的Noxa和Puma基因诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

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1、分类号：Ｒ３４单位代码：１０１８３２０１５７７２０３５；生学号研究：密级：公开吉林大学硕士学位论文学术学位（）受ｈＴＥＲＴ启动子调控的Ｎｏｘａ和Ｐｕｍａ基因诱导肝癌细胞凋亡的实验研究ＴｈｅｓｔｕｄｙｏｆＮｏｘａａｎｄＰｕｍａｅｎｅｉｎｄｕｃｅｄａｏｔｏｓｉｓｏｆｇｐｐｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｈＴＥＲＴｐｒｏｍｏｔｅｒ作者姓名：赵畅专业：再生医学研究方向：肿瘤细胞信号转导指导教师：颜炜群教授培养单位：药学院２０１８年６月受ｈＴＥ

2、ＲＴ启动子调控的Ｎｏｘａ和Ｐｕｍａ基因及其诱导肝癌细胞凋亡的实验研究ＴｈｅｓｔｕｄｙｏｆＮｏｘａａｎｄＰｕｍａｇｅｎｅｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｈＴＥＲＴｐｒｏｍｏｔｅｒ．作者姓名：赵畅领域（方向再生医学指导教师：颜炜群教授类别：再生医学＿Ｔ月日答辩曰期．知４年：ｙ未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改

3、、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学硕士学位论文原创性声明：本人郑重声明所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研宄工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研宄做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担学位论文作者签名：曰期：＾４年６月ＭＳ７中文摘要受hTERT启动子调控的Noxa和Puma基因及其诱导肝癌细胞凋

4、亡的实验研究原发性肝癌（primarylivercancer，PLC，以下简称肝癌）作为一种恶性肿瘤，对人们的身体健康和生活质量有着严重的威胁。肝癌是全球第六大癌症，亦位居我国癌症中的第二位，全球50%以上的肝癌都发生在我国。手术治疗、化学药物治疗、放射治疗、生物治疗、中医中药治疗等是目前治疗肝癌的主要临床方法，但肝癌作为一种有高侵袭性的恶性肿瘤，早期症状不明显，患者一经诊断往往已属于晚期，因此目前肝癌的治疗效果和整体预后仍然很差。近年来，随着对分子生物学和肿瘤学研究的不断深入，选择分子靶向性治疗肿瘤的方法成为了一种新的理想策略。细胞凋亡是一种由多种基因共同调控

5、的细胞程序性死亡过程，通过激活肿瘤细胞凋亡途径可成为治疗肿瘤的一种方式。Bcl-2蛋白家族对细胞的凋亡进程起着调控作用。近年来发现的Noxa与Puma蛋白同属于Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白亚家族BH3-only蛋白家族中的两种促凋亡蛋白，具有较强的促凋亡作用。端粒酶是目前已知的最广谱的肿瘤标志物，人端粒酶逆转录酶（humantelomerasereversetranscriptase，hTRET）是端粒酶的组成部分之一，并是端粒酶激活的关键限速步骤。hTERT在正常细胞中表达量很低，而在肿瘤细胞中表达量很高，在hTERT转录起始位点上游具有多个转录因子的结合

6、位点，提示hTERT启动子不仅具有肿瘤靶向性，并且具有较强的启动活性，可以使基因高表达。因此，本实验拟研究受hTERT启动子调控的Noxa和Puma基因对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的影响及其潜在的分子机制。实验目的：探讨pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma两种真核表达质粒对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的影响及其潜在分子机制。实验方法：（1）细胞增殖分析：两种重组真核表达质粒pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma分别转染HepG2细胞24h、48h、72h后，通过以下实验分析细胞增殖情况：①细胞形态观察：于光学显微镜下

7、观察转染后HepG2细胞形态变化；②CCK-8法分I析转染后HepG2细胞的生存率。（2）细胞凋亡分析：两种重组真核表达质粒pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma分别转染HepG2细胞后，通过以下实验分析细胞凋亡情况：①Hoechst33258染色观察细胞凋亡形态和分析细胞凋亡率；②AnnexinV-FITC分析转染后细胞凋亡率；③Real-timePCR检测凋亡相关基因bcl-2、bax、mcl-1、bcl2A1的mRNA表达水平；④Western-blot分析凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3、cleaved-Caspa

8、se8、cleaved-