htert基因启动子调控hsv论文

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1、hTERT基因启动子调控HSV论文卞卡，张惠中，任继鸿，赵辉，成诗银【关键词】端粒,末端转移酶；启动区（遗传学）；宫颈肿瘤；tk基因【Abstract】AIM:ToobservethekillingeffectofHSVtk/GCVsystemoncervicalcarcinomacellsunderthecontrolofhTERT(humantelomerasereversetranscriptase)corepromoter.METHODS:AneukaryoticexpressionvectorcontainingHSVtkgeneunderth

2、econtrolofhTERTcorepromoteracells(HeLa)andvesselendothelialcells(ECV304)byliposomemethod.TransfectedcellsetrymethodunderthecontrolofhTERTinducedtheapoptosisinmorethan36.7%ofcervicalcarcinomacells,butnotinnormalvesselendothelialcells.CONCLUSION:hTERTgenecorepromoteristumorspecific

3、andmaybeusefulintkgenetherapyofcervicalcarcinomaandinreducingthesideeffectsofthetherapy.【Keyerase;promoterregions(geics);cervixneoplasms;tkgene【摘要】目的：研究人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦（HSVtk/GCV）系统对宫颈癌细胞的体外杀伤作用.方法：构建hTERT基因启动子调控的tk基因真核表达载体pCIneo/hTERTtk，分别用脂质体法转染宫颈癌细胞(

4、HeLa)和正常血管内皮细胞（ECV304），新霉素（G418）筛选阳性克隆扩增.用RTPCR法比较两种细胞tk基因的表达情况；给予前药更昔洛韦（GCV），用流式细胞术检测hTERT调控的HSVtk/GCV系统对两种细胞的杀伤作用.结果：hTERT启动子调控下的HSVtk/GCV系统对宫颈癌HeLa细胞有明显的杀伤作用.freelansimplexvirusthymidinekinase/ganciclovir,HSVtk/GCV）将更昔洛韦（ganciclovir,GCV）等前药磷酸化为细胞毒产物,从而阻止细胞DNA合成,杀伤肿瘤细胞［1-2］.有研究

5、发现，由于缺乏特异性，tk基因修饰的正常组织细胞经前药治疗后会与肿瘤细胞一起被杀死，造成对正常组织的杀伤.hTERT基因在90%的人类肿瘤组织中呈过表达［3］，具有明显的肿瘤特异性.我们采用克隆hTERT基因启动子，利用其在肿瘤细胞中特有的启动活性来控制HSVtk的肿瘤特异性表达的方法，旨在实现其在肿瘤细胞中的特异性杀伤作用.1材料和方法1.1材料TaqDNA聚合酶、限制性内切酶以及电泳中所用markerDL2000和DGL2000均购自TaKaRa公司；T4DNA连接酶购自日本Promega公司；质粒提取、纯化试剂盒购自北京天为时代公司；转染试剂盒Li

6、pofectamineTM2000购自美国Introvigen公司；含人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因与tk基因的pGL3Basic质粒由第四军医大学唐都医院耳鼻喉科韩明鲲馈赠；pCIneo质粒由第四军医大学唐都医院肾内科杨洁馈赠；GCV购自广东丽珠集团；大肠杆菌菌株JM109，宫颈癌细胞HeLa和脐静脉内皮细胞ECV304均由第四军医大学唐都医院临床实验科提供；流式细胞仪美国Coulter公司.1.2方法1.2.1hTERT基因启动子引物的设计和合成设计hTERT基因启动子引物的酶切位点为BglⅡ和HindⅢ,由上海基康生物工程公司合成.上游引物：5

7、′gggagatctagtggattcgcgggcagaga3′；下游引物：5′gggaagcttagggcttcccacgtgcgcag3′.以含有hTERT启动子的质粒为模板进行PCR扩增，循环参数为：94℃2min;94℃30s,67℃30s,.freelin.PCR产物用15g/L琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒回收得到hTERT启动子片断.1.2.2质粒的构建将获得的hTERT片断以BglⅡ和HindⅢ双酶切，得到两端为BglⅡ和HindⅢ位点的hTERT启动子片断，将其连接入pGL3tk质粒相应的酶切位点之间，得到含有hTERTtk基因的质粒pG

8、L3.将以上质粒用BglⅡ和XbaⅠ双酶切，得到hTERTtk基因片断，将其连入