猪圆环病毒2型ORF3蛋白互作蛋白的鉴定

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1、ZSTUZhejiangSci-TechUniversity硕士学位论文Master’sThesis中文论文题目:猪圆环病毒2型ORF3蛋白互作蛋白的鉴定英文论文题目：Identificationofinteractionproteinofporcinecircovirustype2ORF3protein学科专业：生物学作者姓名：徐霄指导教师：于威教授全滟平副教授完成日期：2018年4月17日浙江理工大学学位论文原创性声明本人郑重声明，，是本：我恪守学术道德崇尚严谨学风。所呈交的学位论文人在导师

2、的指导下，独立进行研宄工作所取得的成果。除文中己明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容，。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：４ｈ＇／ｆ／Ａ＆４日期：／年月日浙江理工大学￥位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工大学可以将

3、本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进。行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文保密口。，在年解密后使用本版权书本学位论文：属于不保密。‘「卜ｓｉ学位论文作荇签名：曰期：年Ｉ月３曰＼＼＼＾１指导教师签名：ｈｉ期：年ｂｒｎ浙江理工大学硕士学位论文猪圆环病毒2型ORF3蛋白互作蛋白的鉴定摘要猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2,PCV2）属于圆环病毒科，作为断奶仔猪多系统衰竭综合征（post-wean

4、ingmultisystemicwastingsyndrome,PMWS）的主要病原体，目前对其具体致病机制，特别是病毒与宿主细胞之间的相互作用机制的研究相对匮乏。PCV2属于单股负链环状的DNA病毒，其基因组全长约1.7kb，主要含有3个的开放阅读框（openreadingframe,ORF），分别为ORF1、ORF2和ORF3，其中ORF3编码的105aa的病毒复制非必需蛋白会诱导细胞凋亡。特异性抗体是研究蛋白功能的重要工具。本研究通过构建pET28a-ORF3原核表达载体，获得表达重组ORF3蛋白

5、的基因工程菌，经尿素变性及镍柱纯化的方法得到高纯度的重组ORF3蛋白，通过免疫新西兰大白兔制备获得PCV2ORF3蛋白的多克隆抗体。制备的多克隆抗体能够特异性结合ORF3蛋白的线性表位，但不能识别ORF3蛋白的构象表位。为探究ORF3蛋白与宿主细胞的相互作用关系，本研究建立稳定表达带有SFB标签的ORF3蛋白的PK-15细胞株。利用串联亲和纯化联合质谱分析的方法，筛选到33个与ORF3蛋白相互作用的细胞蛋白，分别涉及细胞骨架、分子伴侣、能量代谢等。经免疫共沉淀和亚细胞共定位技术验证，分子伴侣CCT5蛋白

6、与ORF3蛋白存在特异性相互作用。本研究通过串联亲和纯化联合质谱发现并鉴定到一个ORF3蛋白的互作蛋白CCT5，为深入研究ORF3蛋白及其互作蛋白在PCV2的病毒复制及致病机制中的作用奠定基础。关键词：猪圆环病毒2型；ORF3蛋白；CCT5；互作蛋白I浙江理工大学硕士学位论文猪圆环病毒2型ORF3蛋白互作蛋白的鉴定AbstractPorcinecircovirus2(PCV2)whichbelongstotheCircovirusfamilycausespost-weaningmultisystemic

7、wastingsyndrome.ThestudyonthepathogenicmechanismofPCV2andtheinteractionbetweenhostcellandvirusisstillunclear.Thegenomeisasingle-strand,negative-senseDNAofapproximately1.7kbthatcontainsthreemainlyopenreadingframes,ORF1,ORF2andORF3.ORF3encodeda105aaprotein

8、thatwasnotessentialforviralreplicationbutinducedapoptosis.Specificantibodiesareimportanttoolsforstudyingproteinfunction.Inthisstudy,expressionvectorpET28a-ORF3wasconstructedtoobtaintherecombinantbacteria.ExpressedHis-tagge