功能化环糊精修饰蛋白纳米通道的构建及其应用研究

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1、分类号：０６５７学校代码：１０６９７密级：公开学号：２０１５２０６０３ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ硕士字位论文Ｍ’ＡＳＴＥＲＳＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ功能化环糊梢？修饰蛋白纳米通道的构建及其应用研究学科名称：分析化学作者：慕小雪指导老师：魏永锋副教授西北大学学位评定委员会二〇一八年TheStudyofNanoporeBiosensorBasedontheFunctionalizedCyclodextrinAdaptorAthesissubmittedtoNorthw

2、estUniversityinpartialfulfillmentoftherequirementsforthedegreeofMasterinAnalyticalChemistryByXiaoxueMuSupervisor:YongfengWeiAssociateProfessorJune2018西北大学学位论文知识产权声明书本人完全了解西北大学关子收集保存、使用学位论文的规定。学校有权倮留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被查阋和借阋.本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内容编人有关数据库逛行检索,可

3、以采用影印、缩印或扫插等复制手段倮存和汇编本学位论文。同时技权中国科学技术信息研究所等机构将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》或其它相关数据库.保密论文待解密后适用本声明学位论文作者签名:豸廴夺指导教师签名;'爹刀忽年歹月Σ°(g年‘月/口7日西北大学学位论文独创性声明本人声明:所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果据我所Jn,除了文中特别加以标注利致谢的地方外,本论文不包含其他人已经发表或撰写过n勺研宄成果,也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位域证书而j使用过lJ材料.与我一冂△作hJ冂志对本研究

4、所做的任何贡献均己在论文巾作了l9iof的说明并表示谢簏刊、磅加腥午歹爿冂尸摘要摘要纳米通道检测技术是二十世纪末发展起来的一种操作简单，成本低廉，免标记和高灵敏度的单分子分析方法，已被广泛应用于DNA测序、蛋白质构象分析、酶动力学、生物大分子间相互作用研究以及各种物质的单分子检测，包括核酸、多肽、蛋白质、金属离子和有机小分子等。α-溶血素（α-hemolysin,αHL）蛋白质纳米通道由于自身通常不存在门控效应、结构重现性较好以及易于基因工程修饰，是目前被研究最广的一种生物纳米分析通道。但是，当该生物纳米孔直接用来检测小分子物质时，尤其是

5、阴离子，仍然存在一些困难，比如小分子穿孔速度太快，信号分辨率低以及天然蛋白质纳米通道自身特性限制，不能够很好地实现多种小分子分析物的高灵敏和高选择性同时识别检测。基于此，本文从天然环糊精出发，设计并合成一些带有正电荷基团的功能化β-环糊精衍生物，并将其作为适配器和阴离子识别受体修饰到蛋白质纳米孔腔内，以此构建纳米通道生物传感器，从而实现一些与生物相关的重要阴离子在单分子水平上的选择性识别和传感作用。具体研究内容如下：1、基于咪唑基功能化的环糊精适配器对不同磷酸根的同时识别本文设计并合成了一种新型的全咪唑基取代的β-环糊精衍生物（βCDIM

6、）作为突变蛋白质αHL-(M113R)7纳米孔的适配器和阴离子特异性识别位点，在正常的生理条件（pH=7.4）下检测不同的磷酸根阴离子。实验发现，由于不同的磷酸根阴离子与嵌入蛋白质纳米孔腔内的带正电荷的βCDIM之间静电相互作用力不同，导致了各自电流阻塞信号特征也各不相同，根据残余电流比（I/I0）和（或）滞留时间（τoff）-4-的差异，从而实现了磷酸二氢根（H2PO4，Pi）、焦磷酸根（P2O7，PPi）、三聚磷酸5-根（P3O10，PPPi）和三磷酸腺苷（ATP）的同时识别和检测。此外，该生物纳米孔传感器被成功用于人血浆实际样品中P

7、Pi的免标记识别与检测。该项工作不仅为临床疾病诊断中监控一些具有重要生物功能的磷酸根阴离子水平提供了新的平台，同时在实时DNA测序方面可能具有一定的应用价值和发展潜力。2、设计并合成全-6-脱氧-6-季胺基-β-环糊精（p-QABCD）作为适配器实现对L-半胱氨酸的单分子检测对于生物体内巯基小分子L-半胱氨酸的检测目前已有多种报道，但是发展一种简单快速、高效灵敏的分析方法尤其是在单个分子选择性检测方面仍然存在一定困难。I西北大学硕士学位论文本文从天然环糊精出发，设计并合成了另外一种带正电荷的全-6-脱氧-6-季胺基-β-环糊精（p-QAB

8、CD），并将其作为适配器组装在突变的αHL-(M113R)7蛋白纳米孔内，构建了一种新的纳米孔生物传感体系用于目标分析物L-半胱氨酸的单分子识别。通过记录并分析Ellman试剂（DTNB）与L