猪圆环病毒2型吉林地方株ORF2基因的克隆、测序及原核表达

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1、猪圆环病毒2型吉林地方株ORF2基因的克隆、测序及原核表达摘要猪圆环病毒(Porcinecircovims，PCv)为圆环病毒科圆、环病毒属成员，可分为PCvl和PCv2两个血清型。PCVl无致病性，广泛存在于猪体及猪源细胞系内；PCV2有致病性，是引起断乳猪多系统衰竭综合征(PMws)的病原之一。PMWS是继繁殖与呼吸综合征之后出现的又一猪免疫抑制性疾病，给养猪业带来了巨大的经济损失，已引起世界各国的广泛重视。对Pcv进一步研究表明，Pcvl和PcV2均含有两个主要的开放阅读框，即ORFl和ORF2。ORFl编码与病毒复制相关的蛋白Rep蛋白。此蛋白在

2、两型病毒之间有85％的同源性，是PcVl、PCV2产生抗原交叉性的主要蛋白质。OI心2编码病毒的主要结构蛋白，即核衣壳蛋白(Cap蛋白)。该蛋白在两型病毒之间同源性为68％，不存在交叉反应，且具有较好的免疫原性，对猪圆环病毒病的诊断与疫苗研究有较大的意义。本研究根据GeIlBallk中发表的PcV2ORF2基因序列，设计合成一对特异性引物，用PCR方法从接种经过鉴定的PCV2吉林株(儿01)PK一15细胞中，扩增出PCV2JL01毒株的ORF2基因。将扩增片段克隆于pMD．18T载体，进行序列测定。结果表明，PCV2儿01毒株的ORF2基因核苷酸长度为7

3、02bp。利用分子生物学软件对PCV2几01株ORF2基因与GeIlBaIlk中发表的国内外其他参考毒株0RF2基因进行核苷酸序列同源性比较。结果表明：PCV2儿01株ORF2基因的核苷酸序列与国内不同毒株间的同源性较高，而与国外毒株问该基因核苷酸的同源性相对较低，这可能是不同地区病毒在与宿主相互作用过程中适应宿主免疫反应的进化结果。根据基因分析，设计一对引物，从克隆的pMD．ORF2重组质粒扩增出大小为585bp的部分ORF2基因片段(ORFs)，克隆到pMD．18T载体中，之后转入表达载体pET．32a，经salI和xhoI酶切鉴定，得到阳性重组表达

4、质粒pET．ORFs。将重组质粒pET．0RFs转化到表达宿主菌BL21中，经终浓度为1mmol几的IPTG诱导，成功表达了0RF2基因编码的结构蛋白。经We咖1．Blot检测表明，表达的重组蛋白能够被PCV2阳性血清所识别。由此说明，重组表达的PCV2部分OI江2蛋白具有良好的反应原性。关键词：猪圆环病毒2型，0RF2基因，克隆，表达C10ning，SequencingandExpressingofC妊己F2GeneofPorcineCircovimsType2Is01atedf如mJilinPmvinceAbstractPorcinecircoVir

5、usisamemberofCircoviridae，whichcaIlbedi“dedintotwotypes，PCVl柚dPCV2．PCV2c锄c跏seadise船en锄edpostweaningmunisystemicwastings”drome俨Mws)'whereasPcVlisubiqunous锄dn伽pathogenicforpigs．PMwshasmadeagreat10ssinworld’sswineindustryandarousedpeOple’sanention．B0thPCVlalldPcV2Wereknowedthattlley

6、con协in2m匈or叩enread{ng仔aITles(ORF)matareoRFlaIldORF2．oRFlencodesaput8tiVepmteininvolvedinviralreplication(Repprotein)．RepprotejnofPCVlsharcsabout85％identhywnthatofPcV2，which{sthemajorrcasonofPcVlandPcV2havecrossIreactionof鲫tigenic吼oRF2-codingproductismemajorsmlctIlralpmtein．Thispr

7、oteinsharesabout68％identi母betweentwotypesvims；}loweveLnocmss_reactionofantigenicjtyisobservedbetWeenthem．Therefore，theORF2genecanbeusedt0di脯rentiacePCVIa11dPCv2．AccordingtothenucleotidesequencesofpublishedporcinecircoVimst)，pe2(PCV2)inGellB柚k，apa打ofprimersthatwerespecinctotheORF2

8、geneofPCV2weredesign酣a11dsynthesizedinth