生物化学与分子生物学原理

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1、上篇生物化学与分子生物学原理第一章生物大分子的基本制备技术BasicTechniquesforPreparationofBiomacromolecules生物大分子的制备过程包括选材、细胞破碎和细胞器分离、生物大分子提取纯化、以及样品浓缩干燥和储存等。生物大分子的制备是一项十分细致的工作，既要设法得到它们的纯品，又要努力保持其生物活性。有时制备一个纯度较高的蛋白质、酶或核酸，需要付出较长时间的艰苦劳动。生物大分子制备方法的选择是以生物大分子的理化性质为依据的（表1-1）。对于理化性质不同的生物大分子，所选用的分离提纯方法也不相同。表1-1

2、生物大分子的理化性质与分离纯化方法的选择理化性质分离及纯化方法分子大小和形态差速离心、超滤、分子筛、透析溶解度盐析、萃取、分配层析、结晶电荷差异电泳、等电聚焦电泳、离子交换层析生物功能专一性亲和层析在生物大分子的制备过程中，为随时了解所用方法和条件的效果，以及提取物质的纯度和得率，必须对所提取的生物大分子进行追踪分析鉴定。因此在提纯以前，必须建立对所提取生物大分子相应的分析鉴定方法。以蛋白质的分离纯化过程为例，在分离、纯化过程中，每进行一个步骤都需对所得样品的比活性（总活性/总蛋白）、得率（每一步骤总活性与第一步总活性的百分比，设开始时的

3、总活性为100%）和提纯倍数（每一步骤比活性与第一步比活性的比值，设开始时为1）进行测定。一般认为所得样品的比活性和得率越高以及纯化倍数越大则效果越好。但实际应用中往往须考虑多方面的因素来选择和确定提纯方法及步骤，如对提纯样品纯度和活性的要求、原材料的来源、实验条件以及所用材料的价格等都是我们要考虑的。下面是从猪肝中提纯异檬酸脱氢酶的过程。该提取过程有六个步骤，现将每一步骤所得样品的比活性、得率和纯化倍数等追踪测定结果列于表1-2。据此结果可判断每一步骤的提纯效果。1PDF文件使用"pdfFactoryPro"试用版本创建炣www.fin

4、eprint.cn表1-2猪肝异柠檬酸脱氢酶的提纯及分析总体酶浓度酶总活性蛋白质浓度总蛋白质量比活性得率步骤积提纯倍数（单位/ml）（单位）（mg/ml）(mg)（单位/mg）（%）（ml）组织匀浆7.002.8519.9535.50248.500.0801001.0氯仿抽提5.003.6020.8819.20111.400.1871052.337.5-55%硫酸铵盐析的上清1.5011.2516.8721.4032.100.5258456.5液（透析）DEZE-纤维素2.393.329.091.002.383.82455477离子交换层

5、析磷酸钙层析0.4515.056.770.900.4116.7034209凝胶过滤0.529.805.090.220.1145.60255570从表1-2可知猪肝异柠檬酸脱酶被提纯570倍，得率是25.5%。本章仅以蛋白质分离纯化为例，对一些基本技术进行介绍。电泳、层析、离心技术等将在专门章节给予介绍。一、盐析（Saltingout）盐析方法是蛋白质和酶提纯工作中应用最早，至今仍广泛应用的方法。其原理是蛋白质在高浓度的盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，蛋白质表面的电荷被中和，水化膜被破坏，蛋白质分子相互聚集而从溶液中沉淀析出。盐析法就是根据

6、各种蛋白质在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。在盐析时，蛋白质的溶解度与溶液中离子强度（见第四章电泳）的关系可用下式表示：logS=-K´ISS0式中S0是蛋白质在纯水（离子强度I=0）中的溶解度，S为蛋白质在离子强度为I的溶液中的溶解度，KS为盐析常数。上述公式中当温度和pH一定时，S0仅取决于蛋白质的性质。因此对于同一蛋白质，在一定温度和pH时，S0是一常数。设LogS0=β则LogS=β－KS×I盐析常数KS主要取决于盐的性质（盐的离子价数和离子平均半径）,也和蛋白质的性质有关。不同的蛋白质在同一种盐溶液中

7、的KS值不同，KS值愈大，盐析效果愈好。从上述公式可知在温度和pH一定的同一种盐溶液中，不同蛋白质有各自一定的β和KS值。2PDF文件使用"pdfFactoryPro"试用版本创建www.fineprint.cn可以通过改变盐的离子强度来分离不同的蛋白质。这种方法称分段盐析法。对于同一种盐溶液，如果保持离子强度不变，通过改变温度和pH来改变β值，也可达到盐析分离的目的。这种方法称为“β分段盐析法”。盐析法提纯蛋白质时应注意以下几个条件的选择。（一）盐的种类蛋白质盐析常用中性盐。主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。应用最广泛的是

8、硫酸铵，其优点是：1．溶解度大25℃时硫酸铵的溶解度可达4.1mol/L(541g/L)以上。大约每升水可溶解767g之多。在这一高溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以被盐析沉淀出来。2．温度系