高效液相色谱法分离大豆蛋白肽

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1、第22卷第2期齐齐哈尔大学学报Vol.22,No.22006年3月JournalofQiqiharUniversityMarch,2006*高效液相色谱法分离大豆蛋白肽卢鹤郑永杰齐齐哈尔大学化学与化学工程学院齐齐哈尔161006摘要本文采用Alcalase碱性内切蛋白酶为工具酶水解大豆蛋白通过实验选择最佳水解条件采用超滤以及凝胶过滤色谱法(SephadexG―15)分离出分子量1000以下的小肽并收集,将收集到的不同功能性目标肽段在最佳色谱条件下进行分离关键词高效液相色谱大豆肽超滤凝胶过滤+中图分类号O657.72文献标识码A文章编号1007-984X(2006)02-0

2、001-03本文研究的大豆肽是指大豆蛋白经过水解分离精制等过程而获得的通常由36个氨基酸组成的相对分子质量低于1000的肽类混合物肽类的相对分子质量主要分布在300700范围内其中还含有少量的游离氨基酸糖类无机盐等成分近些年来具有重要生物活性的新肽不断被发现原有的肽类也不断被发现具有新的生物功能这些肽类在各种生理活动中都起着重要作用高效液相色谱(HPLC)已广泛用来分离分析和制备多肽[1-2]蛋白等生物样品尤其是反相高效液相色谱已成为许多研究肽类的实验室的主要分离分析手段本文采用反相高效液相色谱RP-HPLC考察了梯度条件和TFA用量对大豆肽样品分离的影响建立了大豆肽的R

3、P-HPLC的分离分析方法为下一步液相色谱质谱联用测序提供了实验的依据1实验部分1.1仪器与试剂仪器高效液相色谱系统大连依利特分析仪器有限公司包括:P230高压恒流泵UV230紫外检测器EChrom98色谱工作站ODSHYPERSILC185um,250mm4.6mmHIS―H水浴振荡器PHS-25型酸度计80-2型离心沉淀机BS110S型电子天平超滤装置BSI―100自动部分收集器722―光栅分光光度计1000>L移液器GM―0.33隔膜真空泵试剂与样品大豆分离蛋白(蛋白含量﹥95%)Alcalase碱性蛋白酶pharmacia公司葡聚糖凝胶G15(上海亚东核级树脂有限

4、公司)NaOH分析纯HCL分析纯磷酸二氢钠分析纯磷酸氢二钠分析纯色谱纯乙腈天津科密欧科技有限公司三氟乙酸(TFA)色谱纯1.2实验步骤1.2.1酶水解实验1.2.1.1酶水解反应配制底物浓度为6%W/V的大豆蛋白分离溶液80预处理10min后将温度调至55置于恒温水浴振荡器中恒温用1mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH值至8.5然后以加酶用量为50mL/kg加入Alcalase碱性内切蛋白酶置于恒温水浴振荡器中振荡水解大豆分离蛋白在反应过程中及时加入1mol/L的氢氧化钠溶液以维持大豆分离蛋白溶液的pH在8.50.1的范围内反应2.5h后将酶解液迅速升温至90恒温10mi

5、n以钝化蛋白酶冷却后用4000r/min的离心机离心分离1.2.1.2超滤分离收稿日期2005-10-15基金项目黑龙江省自然科学基金项目B0314作者简介卢鹤女1982年生分析化学2004级研究生2齐齐哈尔大学学报2006年将水解产物1000mL分别通过三种超滤膜进行分离分别获得分子量在>200002000010000100006000<6000四个肽段1.2.1.3凝胶过滤分离将6000以下的肽通过SepHadexG15进行分离收集分子量1000以下的肽段1.2.2高效液相色谱条件实验将分子量在1000以下的小肽用0.1%TFA水溶液溶解后取一定浓度的小肽样品溶液进样

6、至已用流动相A液水+0.1%TFA(V/V/%)平衡过的RP-HPLC色谱上然后进行凸形梯度洗脱直至达到要求的B液浓度乙腈+0.1%TFA(V/V/%)流动相AB液需超声脱气后使用再用100%B液洗脱30min,使残余在柱上的物质完全冲洗下来然后再用相应浓度的A液使柱平衡以构成一个完整的色谱过程流速1.0ml/min,大豆肽的检测波长为220nm.2结果与讨论部分2.1洗脱条件的选择反相高效液相色谱分离复杂肽的混合样品时通常使用含TFA的水和乙腈为流动相以梯度洗脱[3]的模式进行分离梯度变化速率对色谱峰形和分离度有较大影响为此首先选择不同的恒洗条件进行分离实验为下一步采用

7、梯度洗脱提供依据实验比较了流动相体积比分别为乙腈从10%到100%每次增加10%水从90%到0每次减少10%TFA始终为为0.1%时的分离行为其中乙腈水=1090和乙腈水=5050时的分离谱图如图1所示A.乙腈水=1090B.乙腈水=5050图1样品在不同恒洗条件下的分离在恒洗方式的基础上进一步设计采用不同的梯度洗脱条件进行分离通过分离效果比较确定采用凸形梯度方式为最佳梯度洗脱方式具体实验条件为流动相从水TFA=1000.1到乙腈:TFA=100:0.1,梯度方式为凸形梯度分离谱图如图2所示图2样品在凸形梯度下的分离谱图从采用