Aβ42及其亚单位多价DNA疫苗的构建及对BALBc小鼠的免疫学效应

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1、Afl42及其亚单位多价DNA疫苗的构建及对BALB／c小鼠的免疫学效应博士生：张革导师：姚志彬学科专业：人体解剖与组织胚胎学研究方向：老年性痴呆疫苗研制及免疫治疗摘要研究背景和目的老年性痴呆(Alzheimcr'sDisease，AD)是一种以进行性认知障碍和记忆力减退为临床特征的中枢神经退行性疾病，随着社会老龄化现象的日趋加剧，AD患病率明显增高，且没有理想的防治措施，研究和开发防治AD的药物己成为老年医学亟待解决的问题。近年对AD的病因及发病机理的研究表明，AD病理机制的中心环节是B一淀粉样蛋白(p—amyloidpeptid

2、e，AB)的生成、沉积和老年斑(Senileplaque，SP)的形成及其伴随的神经元损害。其中42个氨基酸的AB蛇是SP的主鹦日扮j故清除和防止Ap42沉积随之成为治疗AD新的靶点。1999年Schcnk．D等首次采用地2肽主动免疫PDAPP(Ae静体蛋白基因)转基因鼠，产生的A8抗体不但减少了AD转基因鼠脑内sP的沉积，还明显改善了转基因鼠的行为学和认知障碍。随后其他多个研究小组采用主动和被动免疫方式都证实以A(3‘2为靶的免疫治疗是AD防治的一条有效的新途径。2001年，Elan公司率先研制以QS21为佐剂的AB42肽疫苗AN

3、l792，并进入临床实验。临床I期实验效果良好；2002年初的临床Il期实验病例分析表明，ANl792肽疫苗在防治AD确实有效，但6％病人接种后出现无菌性脑膜炎，试验被迫中止。尽管对颅内炎症的原因存在争论，但多数研究者认为AB42肽C末端的T细胞表位激发Till型自身免疫反应，从而诱发了炎症反应。因此，在肯定A13免疫治疗效果的同时，AD防治的研究重点转向寻找高效，安全的替代疫苗和免疫方式。其中一个重要方向是采用Afl42肽的B细胞表位作为抗原，联合Th2型免疫佐剂，以及诱生Th2型免疫的接种方式来免疫治疗和预防老年性痴呆。另外，由

4、于DNA疫苗可引起体液免疫和细胞免疫，且联合Th2型细胞因子可诱导Th2型免疫为主的免疫反应，并且制备及免疫方便，可以构建多价疫苗等优点，已经被作为AB肽免疫治疗的一个潜在候选方案。在A阢免疫防治AD中，Ap抗体检测至关重要。A8抗体检测一般采用台成的AB42抗原作为包被抗原，间接ELlSA法检测，但由于AB42抗原溶解后易于聚集形成沉淀，可从包被板上脱落，造成结果不稳定，且合成价格昂贵，固其抗体检测方法仍需改进。鉴于以上因素，在本室A№及MAP—Apl5肽疫苗研究的基础上，本课题首先拟用原核表达纯化的GST-AIB42抗原替代化学

5、合成的Afl42作为检测抗原，建立一种价廉和稳定的WesternBlot和间接ELISA检测Ap抗体的方法。重点以单价和多价A1542及其B细胞表位ADl啪作为抗原，分别构建DNA疫苗，免疫BALB／e小鼠，研究分泌型多价A1j42和ABI_15DNA疫苗诱导AB特异抗体产生的能力，免疫反应的类型以及疫苗安全性。初步探讨ABDNA疫苗应用于AD防治的潜在可能性。材料和方法1、人A肛犯重组抗原的融合表达及Ap抗体的检涮选用大肠杆菌优选密码子，化学合成Afl42基因两个互补片段，通过多重PCR扩增人AB42基因，克隆至pGEX．2T表达

6、载体中，原核表达并亲和纯化GST-A1342融合蛋白。WesternBlot检测其抗原特异性。以(}SToAt42和A№肽分别为包被抗原，间接ELISA法检测AB42肽免疫的sD大鼠血清中A口抗体n2、A‰重组多价DN&疫苗的构建及诱导▲p抗体的产生PCR法从T92576转基因鼠基因组DNA中扩增人A陷基因片段；在A№基因的5’端引物延伸连接小鼠IgGlc轻链信号款序列：利用GSGGSGlinker基因串连两段A1342基因片段；将产物克隆)kpeDNA3．1表达载体，分别构建非分泌型A1342疫苗H以及一价分泌型sAl342，二价

7、分泌型s2×Aft42疫苗；分别转染COS-7细胞，免疫印迹检测各自Afl42的表达i肌肉注射免疫BALB／c鼠，加强免疫5次。阀接ELISA法测定抗体效价；、ⅣegtemBlot检测抗体与6ST-AIh2抗原的特异结合；免疫组织化学和Aft42肽抗原的中和实验捡测抗血清与T92576转基因鼠老年斑特异结合的能力；MTr法检测免疫后脾细胞在Ap42抗原刺激下细胞增殖水平，流式细胞仪检测诱导产生Thl和Th2型细胞。3、婶,-15多价瑚她痰苗的构建及对劭嗵胁鼠的免疫学效应基因合成和PcR技术扩增以多个甘氨酸连接的ABl-15二价基因片

8、段；在N端引物延伸加上小鼠IgG-c轻链信号肽序列：GSGGSGlinker再串连两段Apl．15二价基因片段，克隆)＼pcDNA3．1表达载体，构建s4XApl5DNA疫苗载体；转染COS·7细胞，WesternBtot检测分泌型四