控制稻瘟菌菌丝生长基因的克隆

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1、中国农业大学硕士学位论文控制稻瘟菌菌丝生长基因的克隆姓名：李茂华申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：国立耘;彭友良20040601摘要稻瘟茁(Magnaporthegrisea)可侵染多种禾本科植物，是引起水稻稻瘟病的病原真菌，也是研究植物病原真菌的模式真菌之一。通过筛选稻瘟菌的REMl转化体库，获得一个生欧缓慢型突变体$2514。在CM固体培养基上突变体$2514的菌落生长速度是野生型P131的45％。通过与其野生型菌株P131主要生物学性状的比较。发现$2514不仅生长缓慢，而且在分生孢子形态以及致痛性上也发生了改变。与P13l相比，$2514的分生

2、孢子明显变短变粗，表现为孢子不成熟：而且完全丧失了对感病寄主丽江新团黑谷致病性。通过遗传杂交确定突变体$2514菌丝生

3、殳缓慢、分生孢子形态变异以及致病性丧失的突变表型是由于REMI转化过程中外源质粒的插入引起的。通过Southernblot分析确定质粒在基因组中是单位点插入，并且通过质粒拯救获得了插入质粒右侧的侧端序列。测序后与稻瘟菌的基因组数据库进行比较，确定这段序列位于Conti92．1938，定位在稻瘟菌的第V条染色体上，插入位点在此Contig的6635的位置。而先前获得的插入质粒左侧的序列位于Conti92．610，定位于第Ⅶ条染色体。插入质粒两端的

4、序列被定位于两个不同的染色体上，可能是由于在REMI转化过程中基因组DNA的缺失或重捧造成的。用GENSCAN预测出质粒插入位置右侧的基因是一个编码656个氨基酸的基因。以侧端序列为探针筛选稻瘟菌基因组TAC文库获得9个阳性克隆，从刚性克隆上得到包含完整基因的片段将用于构建互补载体，通过互补实验证明质粒插入位置右侧的基因是控制该突变表型的基因。互补载体的构建以及互补实验正在进行中。关键词：稻瘟茁，菌落生长缓慢．REMI，质粒拯救，阳性克隆AbstractMagnaporthegrisea,whichCaBinfectmanygrasses，isthepathog

5、enicfunguscausingriceblastdisease．Ithasbeenusedasamodelforstudyinginteractionsbetweenplantandphytopathogenicfungi．Isolate$2514thatobtainedbyscreeningREMIlransformantlibraryisaslow-growthmutant．OntheCMsolidmedium，hyphalgrowthrateof$2514is45％ofthewildtypestrainP131．Also，IsolateS2514isn

6、otonlyamutantwithslowhyphalgrowthratebutalsowithabnormalconidiaandpathogenicdeficiency．ComparedwiththewildstrainP131．theconidiaofS2514isshorterandwider；andiscompletelylostitspathogenicitytothesusceptiblecultivar．Theresultofgeneticanalysisindicatedthatthechangeinhyphalgrowth，conidiamo

7、rphologyandpathogenicityiscausedbytheinsertionoftheplasmidthroughREMI．Southernblotanalysisrevealedthatthemutanthadasinglesiteinsertionofthemarkedplasmidinitsgenomeanda18kbsequenceflankingtherightsideofinsertionplasmidwasyield．Bycomparingtheflankingsequencewiththatofthericeblastgenome

8、，itwasfoundthattheflankingsequenceWaSlocatedoncontj92．1938oftheChromosomeV．Howevertheflankingsequenceonleftsideoftheinsertionislocatedoncontil92．610oftheChromosomeVII．Thel'easonthattwoflankingsequencesislocatedondifferentChromosomesmaybeduetoDNAdeletionorDNArecombinationduringREMI．GE

9、NSCANwiththe