稻瘟菌基因的gene-replacement试验.doc

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1、稻瘟菌基因的Gene-replacement试验随着几种模式生物，尤其是人的全基因组序列的完成，生命科学的研究进入了一个功能基因组学的时代。人们已经不仅仅关心一个基因组中包含有多少基因，更重要的是包含有多少有功能的基因，各个基因的功能分别是什么。稻瘟菌是分子遗传研究的良好材料，具有易于人工培养，已有高效率的人工转化体系，在实验室可进行有性杂交，菌丝体为单倍体等特点。稻瘟菌的基因组一共包括七条染色体，全基因组的大小约为38Mb，包括大约10000个基因，平均3-4kb就有一个基因。由于稻瘟菌的菌丝体为单倍体，每一个基因的突变都能引起其相应生理生化功能的变化，因此当把基因组中某一功能基

2、因用选择标记替换，或直接把这段序列缺失掉时，就能导致这个基因功能的丧失，从而了解基因的功能。Gene-replacement试验的原理是通过部分序列被替换的突变基因与基因组中的正常基因的同源重组，造成基因组中相应基因序列的破坏，从而研究基因的功能。一般包括以下几个步骤：首先，将基因的全长克隆至细菌载体上；然后，用一个真核生物的选择标记，一般为潮霉素抗性基因和新霉素抗性基因等，代替基因的一部分；第三，选用合适的限制性内切酶将质粒切为线形；第四，利用REMI转化体系转化野生菌株；第五，挑取抗性转化子；最后，PCR鉴定和基因组Southern杂交鉴定。以上所用的实验步骤是基于REMI转化

3、的，由于REMI转化的机制是随机插入，因此在Gene-replacement试验的转化体中有大量的不是因同源重组而得到的Gene-replacement试验转化体，而是随机插入转化体。因此载体构建时留一个相对较长的用于同源重组的侧臂，并且转化时降低每个转化体系中的质粒量，能有效的提高转化体中Gene-replacement转化体的比率。实验材料与设备A．实验材料：1．稻瘟菌菌株：P131，用于REMI转化的野生菌株；2．与分生孢子形态有关基因所在的TAC克隆2N14；3．细菌载体：pUC18；pGEM-7zf；pUCATPH(hygB+)；4．工具酶：限制性内切酶（Takara，大

4、连）；连接酶（Takara，大连）；CIAP（Promega，美国）；5．培养基：细菌培养基：LB，SOB（配方参照《分子克隆》第二版）；稻瘟菌培养基：西红柿燕麦培养基（每升含150毫升西红柿汁，40克燕麦片加水煮沸20分钟后过滤，15克琼脂）；CM培养基（0.6%yeastextract；0.3%酶水解干酪素；0.3%酸水解干酪素；1%蔗糖；1.6%琼脂）6．REMI转化用培养基及试剂（参照实验：稻瘟菌的REMI转化）；7．其他试剂：苯酚：氯仿（异戊醇），3M醋酸钠，70%乙醇，无水乙醇，TE（pH8.0），ddH2O；B．实验设备：恒温水浴；高速冷冻离心机，台式冷冻离心机；电击

5、转化仪，恒温摇床实验步骤1.与分生孢子形态有关基因所在的Contig1.1332酶切位点分析：根据GeneScan分析，这个位点位于这个Contig的第四个基因，从21504到28970。在Contig1.1332的19306和29823的位置分别有一个SphI的酶切位点，这两个酶切位点间的大小为10.5kb，，不再含有SphI的酶切位点，并且包括了第四个基因的全长。在Contig的20963，23686，27146的位置各有一个ApaI的酶切位点，在Contig的27853的位置有一个XhoI的酶切位点，用ApaI和XhoI双酶切能切掉包括基因启动子在内的基因的大部分。2.用Sp

6、hI酶切克隆2N14，回收10.5kb的带，与SphI酶切，末端去磷酸化后的载体pUC18连接，得到不同连接方向的两个质粒PS2和PS9。3.用XbaI酶切质粒pUCATPH，回收2kb的包含潮霉素抗性基因的带，与XbaI酶切，末端去磷酸化后的载体pGEM-7zf连接，得到质粒7h6。4.用ApaI和XhoI双酶切PS2，回收6.2kb的包含有载体pUC18的带。5.用ApaI和XhoI双酶切7h6，回收2kb的包含潮霉素抗性基因的带，与步骤4中的片段连接，得到质粒PSH。6.用SmaI酶切PSH，使其成线形。7.用线形化的PSH转化稻瘟菌P131的原生质体。（具体步骤见实验：稻瘟

7、菌的REMI转化）。8.从含潮霉素浓度为300ug/ml的topagar挑取抗性克隆，转接至含潮霉素浓度为250ug/ml的CM培养基进行抗性确认。9.根据被替换的ApaI和XhoI之间的片断合成引物，从潮霉素抗性的转化体的DNA中扩增被替换的部分，因同源重组而得到的Gene-replacement试验转化体不能扩出相应的片断，而随机插入转化体能扩出。10.Gene-replacement转化体的基因组southern杂交确认：用ApaI酶切P131，Gene-rep