禽呼肠孤病毒σ3基因的真核表达及σNS基因的原核表达与序列分析

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1、禽呼肠孤病毒O3基因真核表达质粒免疫效果的研究及ONS基因的原核表达与序列分析摘要禽呼肠孤病毒(Avianreovirus，ARV)感染在世界范围内存在，主要引起鸡和火鸡的病毒性关节炎＼腱鞘炎，吸收障碍综合症和慢性呼吸道疾病。感染鸡出现免疫抑制而引起继发性感染，死亡率升高等等，造成比较大的经济损失。近年来研究者对ARV，进行了不同的检测诊断方法及不同类型疫苗的探索。课题分别对ARVo3基因构建的真核表达载体(pcDNA-o3)、构建的重组载体pcDNA．O3的免疫效果、ARV非结构蛋白oNS的克隆表达及序列分析进行了研究。采用RT-PCR技术扩增禽呼肠孤病毒ARVS1133株的O3基

2、因，将o3基。因克隆至真核表达载体pcDNA3．1(+)载体上，获得重组质粒经PCR、酶切以及序列分析鉴定，表明插入的片段为o3目的基因，插入的位置、大小和阅码框架均正确，成功构建了真核表达载体重组质粒pcDNA—o3。分别制备pcDNA．o3DNA疫苗、ARV灭活苗及o3蛋白苗，将制备的疫苗分别免疫SPF鸡(各10羽)2次后，用ARVS1133株对DNA疫苗免疫组、r灭活苗免疫组、o3蛋白免疫组及对照组进行攻毒。攻毒4天后采集鸡的内脏组织器官经处理后使用RT-PCR方法进行检测。RT-PCR的检测结果为DNA疫苗免疫组(10％)检出率与对照组(30．9％)差异显著(p<0．05)，

3、与灭活苗免疫组(7．4％)及o3蛋白免疫组(3．7％)差异不显著(p>0．05)。说明用构建的pcDNA—O3免疫SPF鸡，鸡只获得了较好的免疫保护。研究还采用RT-PCR技术，扩增10株禽呼肠孤病毒oNS非结构蛋白基因，将S1133株与广西分离株R2的0NS基因克隆到表达载体PGEX-4T-I获得重组质粒(PGEx一1133．oNS，PGEX．R2．oNS)，其他8株的oNS基因克隆至PMDl8．T载体，对阳性质粒进行序列测定。对阳性重组质粒IPTG的诱导浓度、诱导时间和诱导温度等条件进行了试验。结果显示，目的蛋白分子量约为66．2ku，约占菌体总量的31．5％．33．3％，1PT

4、G最佳诱导浓度为0．8mmol／L，最佳诱导时间为4h，最适诱导温度为28．37。C。37℃及32℃诱导时，目的蛋白ONS主要以包涵体的形式存在，28℃诱导时，目的蛋白oNS主要以可溶性的方式表达。利用28℃诱导表达目的蛋白ONS，用谷胱苷肽活化的Sepharose4B亲和层析柱纯化，测定纯化蛋白的浓度。结果显示纯化后目的蛋白纯度达到93％，浓度为0．91mg／ml。Western-blotting分析表明，目的蛋白能够与ARV阳性血清发生特异性反应，表明该重组蛋白具有较好的抗原性。阳性重组质粒序列测定结果表明，所构建的克隆质粒中均含有相应的oNS蛋白基因，大小为1107bp，编码3

5、69个氨基酸。序列分析表明，此8株ARV的oNS基因的核苷酸，与标准毒株S1133和1733株的同源性为98．8％～99．9％，其中R1株在第80位缺失了一个核苷酸。结果表明，除R1株外，其它ARV毒株的oNS基因变异不大。关键字：禽呼肠孤病毒o3genepeDNA3．1(+)oNSgene表达序列分析l*STUDIESoNTHEIMM叮NOLoGICALEFFICACYoFRECoM皿INANTPLASM【DWITHo3GENEAGAINST√研ANImoⅥIⅢSANDCLoMNGANDSEQUENCEANALYSISoFoNSGENEAvianreovirus(ARV)infec

6、tionexsitinthepoultryindustryaroundtheworld．ARVscancauseviralarthritis，tenosynovitis，malabsorptionandchronicrespiratorydiseases，anditisalsooneoftheimmunosuppressivediseasesandsubsequentlyresultsinmoresusceptivetotheinfectionofotherpathogens，andcauseseriouseconomylossforpoultryindustry．Alotofres

7、earchersareexploringthedifferentdiagnosticmethodanddifferentvaccineofARVinrecentyears·Theconstructionofrecombinantplasmid(pcDNA—O3)with03geneagainstAvianreovirus；theimmunologicalefficacyoftherecombinantplasmid(pcDNA一03)；thecloning