禽呼肠孤病毒l2基因的克隆与序列分析

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1、分类号S852.62学校代码10129UDC11.220学号2009201073牛支原体PCR检测方法的建立及流行病学调查禽呼肠孤病毒L2基因的克隆与序列分析CloningandSequenceAnalysisoftheL2GeneofAvianReovirus申请人：党娟学科门类：农学学科专业：预防兽医学研究方向：动物传染病学指导教师：关平原教授论文提交日期：二〇一二年五月摘要本试验提取禽呼肠孤病毒天津地区分离株（ARVT-98）和内蒙古地区分离株（ARVC-98）病毒的总RNA。参考GenBank中禽呼肠孤病毒176株（ARV17

2、6）的L2基因序列设计了5对特异性引物。应用一步法RT-PCR技术扩增禽呼肠孤病毒的L2基因。将回收纯化得到的目的DNA与pEASY-T1载体链接，转化到感受态细胞，用蓝白斑法筛选阳性重组质粒，再用PCR法鉴定阳性重组质粒，然后将PCR鉴定为阳性的重组质粒送英潍捷基（上海）贸易有限公司（invitrogen）进行序列测定。应用DNAstar软件将测定序列进行拼接并与参考序列进行比较分析。结果显示L2基因节段长3830bp，均含有完整的开放性阅读框(OpenReadingFrame，ORF)，编码区位于15～3794bp。测定的禽呼肠孤

3、病毒C-98、T-98株的L2基因序列已经登录GenBank，登录号分别是JN641888、JN641889。ARVC-98和ARVT-98的L2基因核苷酸及其推导的氨基酸的同源性均很高，分别为99.7%，99.4%；与ARV176、ARVS1133、ARV138、和ARVAVS-B的L2基因核苷酸同源性在83.9%～99.7%之间，推导的氨基酸同源性在96.4%～99.6%之间；与MRVBYD1、MRVSC-A、MRVT3D和MRVT4N的L1基因核苷酸同源性在53.4%～54.4%之间，推导的氨基酸同源性在53.9%～54.4%之

4、间。系统发生树表明，ARVC-98、ARVT-98与ARV176、ARVS1133、ARV138、和ARVAVS-B处于同一进化分支，其中与ARV176和ARVS1133的遗传进化关系最近。与MRVBYD1、MRVSC-A、MRVT3D和MRVT4N处于不同的进化分支，遗传进化关系较远。关键词：禽呼肠孤病毒；L2基因；克隆；序列分析CloningandSequenceAnalysisoftheL2GeneofAvianReovirusAbstractThetotalRNAofAvianreovirus(ARV)isolatedinin

5、nerMongoliaandTianjinwasextracted.AccordingtothepublishedL2genesequenceofavianreovirusstrain176inGenBank,fivepairsofprimerweredesigned.TheL2geneofviruswereamplificatedbyRT-PCRandthenclonedintopEASY-T1plasmidsandthensequenced.Theresultshowedthateachoftheacquiredsequences

6、L2genewere3830bpincludingawholeopenreadingframe(ORF15-3794bp).TheaccessionnumbersofARVC-98、T-98wasJN641888、JN641889,respectivelyinGenBank.TherewerehighhomologyinnucleotidesequencesandthededucedaminoacidssequenceofL2genebetweenARVC-98andARVT-98,99.7%and99.4%respectively;

7、ComparedwithARV176、ARVS1133、ARV138andARVAVS-B,thehomologiesofthenucleotidesequenceofL2generangedfrom83.9%to99.7%andthededucedaminoacidssequencesrangedfrom96.4%to99.6%;ComparedwithMRVBYD1、MRVSC-A、MRVT3DandMRVT4N,thehomologiesofthenucleotidesequenceofL1generangedfrom53.4%

8、to54.4%andthededucedaminoacidssequencesrangedfrom53.9%to54.4%;ResultsofphylogenetictressindicatedthatARVC-98、A