人TRAb噬菌体抗体库的初建

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1、天津医科大学硕士学位论文人TRAb噬菌体抗体库的初建姓名：赵禹申请学位级别：硕士专业：内科内分泌指导教师：陈昆明20030501中文摘要本实验的目的是通过半套式RT．PCR扩增甲亢(Graves病)患者样品单个核细胞中抗体可变区编码基因vH，V。并运用重叠伸展PCR技术将连接序列(Gly，Ser)，组装成单链基因(ScFv)并克隆到噬菌体中建立TRAb(促甲状腺激素受体抗体)单链噬菌体抗体基因组合文库。为进一步，筛选人源TSAb(甲状腺刺激抗体)，TSBAb(促甲状腺激素受体阻断抗体)航体活性片段打下基础。方法：(1)TRAb单链抗体基I习(ScF

2、v)的构建：从TRAb，TSI均阳性Grave’S病患者的外周血中分离单个核细胞，提取rnRNA。并反转录成cDNA。分别以人VK5’可变区兼并引物(与第一骨架区互补)，人VK3’兼并引物(部分与J段互补)PCR扩增抗体轻(V．)链可变区基因。以人V。5’兼并引物(与第一骨架区互补)，人V。3’可变区兼并引物(与j段互补)PCR扩增抗体重(V。)链可变区基因。然后，用重叠剪切PCR(SOE)方法，将V。和V。用一个linker(人工合成的36个寡核苷酸序列)连接起来(V。．-linker-V。)，构建人单链抗体库(singlechainFvfrag

3、ments，ScFv)的基因。本实验结果：PCR产物经1．7％琼脂糖凝胶鉴定，分别在420bp和380bp左右见到V。和V。扩增带，与文献报道的基本一致，也证明所用的兼并引物有效。V。，-linker-VH的PCR产物经1．7％琼脂糖凝胶鉴定，可见在800bp左右见到扩增带，与假设相符，证明用SOE法将抗体轻中重链可变区基因通过一27个核苷酸的linker连接起来是成功的。(2)人TRAb单链噬菌体抗体库的构建。将VI．-linker．VH和p3SCMH分别进行双酶切并进行连接，并将此重组噬菌粒电转化人E．coliXLl．blue中。为了精确的对D

4、NA定量，我们采取了紫外DNA吸收光谱值和电泳下荧光亮度相结合的方法。在电转化的过陧中，我们优化了电压、电容、受体菌浓度及转化子量以期获得最大的库容。取出少量样本，铺于sB双抗板中以判断库容(我们的库容单位是单个ScFv重组子)。实验结果是令人鼓舞的，3+6×lO'库容能够满足后续实验的要求。加入辅助噬菌体VCS—MI3后．上清经过收集，离心及重悬，既可得到ScFv抗体库(也就是噬菌粒库)。噬菌体抗体库滴度(CFU)为4．2×10“CFU／ml。此滴度也符合要求。因此可以得到如下结论：1．本实验所用的分别针对轻重链可变区基因的兼并引物能够扩增出单一

5、的区带，与相关文献报道相符，证明这二对引物是有效的。SOE是随机将二个PCR产物片段连接在一起的一种省时，有效的方法。2．本实验的难点是如何用电转化的方法构建相对大的库容。我们经反复优化相关影响因素，进一步提高了DNA提取质量及精确的DNA定量，终于较理想的达到了预期的库容。为下一步TRAb的筛选打下了坚实的基础。Abstraet“MyassignmentistOconstructaTRAb(TSHreceptorantibody)combinatoriallibraryphageantibodylibraryfromGravespatients．

6、Methods：VL-linker-VHpreparation．mRNAwasextractedfromperipheralbloodlymphocyte(about15rnl)ofGravespatientswho’STRAbandTSlwerepositive(detectedbyTRAb,TSIAssayKiousingGIBCO’TRIZOLreagents．cDNAcloningwasdonebytheReverse’transcriptionSystem(Promega)．Diverselibrariesofimrnunoglobuli

7、nlight(VL)chainvariablegenewasamplifiedusingVK5’primerwhichtargetshumanfirstframemgionandhumanVK3’primerwhichtargetsJgenefragmentswhileinclude27artificialoligonucleitides—liker．VHgeneswastheproductofPCRusinghummtVH5’linkerwhichtargetshumanfirstframeregionwhileinclude27artifici

8、aloligonucleitides～liker，andVH3’primerwhichtargetsjoiningfrag