抗虫耐草甘膦多价转基因玉米的研究

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1、东北农业大学博士学位论文抗虫/耐草甘膦多价转基因玉米的研究姓名：赫福霞申请学位级别：博士专业：植物学指导教师：黄大昉20080620摘要玉米是大宗粮食作物，又是重要的饲料和工业原料，由于虫害和草害的威胁，导致其产量和质量严重下降。基因工程的诞生为玉米虫害和草害的防治提供了有效手段。G2．epsps基因是从草甘膦长期污染的极端环境中分离的荧光假单胞菌(psedomonas／luorescensG2)中克隆的新基因，具有自主知识产权。为提高耐草甘膦基因G2一epsps在转基因玉米中的表达水平，首先对摹冈进行了植物密码子优化，改造后的基冈命名为2raG2．epsps基因，优化后基因的e卜c含量由原来

2、的58％调整到了53％，与G2．epsps基因核苷酸序列相似性为89％。为使该草甘膦抗性基因编码产物正确定位于叶绿体，克隆了拟南芥的EPSPS酶的叶绿体转运肽序列，大小为244bp，测序结果表明该序列与已知序列的相似性为100％。BtcrylAh基因是从我国自行分离的苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)菌株BT8中克隆的新型杀虫蛋白基因，crylAh基因的编码产物对鳞翅目害虫的杀虫活性强于目前使用的crylAc或者crylAb基因。crylIe基因是本研究组克隆的另一个具有自主知识产权的Bt杀虫基因，其编码蛋白对敏感玉米螟和抗性玉米螟均有一定毒力。crylIe与c

3、rylAb和crylAc无交互抗性，将crylAh和crylle构建到同一表达载体中，能够更为有效地克服现有Bt基因同源性高、种类单一、昆虫对Bt蛋白产生抗性等问题，同时可望获得抗虫性更好的转基因植物。·本研究利用抗虫基因crylAh和耐草甘膦基因2坍G2一epsps构建了双价植物表达载体，通过基因枪轰击转化玉米，以2研G『2．epsps为筛选标记基因，以草甘膦异丙胺盐作为筛选剂，获得到了抗性较好的TO代转化植株80株。通过对TO、T1、T2代转基因植株的分子检测、抗虫生物活性检测、田间草甘膦抗性检测表明，共获得了5个能够稳定遗传具有抗虫性和草甘膦耐受性的转基因玉米品系。同时构建了含有Btcr

4、ylAh和crylIe基因和耐草甘膦2所G2．epsps基因的三价植物表达载体，通过基因枪轰击法转化玉米愈伤组织，以2raG2．epsps为筛选标记基因，以草甘膦异丙胺盐作为筛选剂，获得To代转化植株69株，PCR检测结果表明：有17株已完整的整合有抗虫基因crylAh、crylIe和耐草甘膦基因知G2一epsps的3个目的基因，RT-PCR分析外源基因可以正确转录，已获得结实转基因植株。三价转基因玉米的获得为我国多基因双抗性转基因玉米的研究打下了基础，为下一步的玉米育种提供了材料。实验中以2朋G2．epsps基因作为筛选标记基因，为确定其筛选时间及筛选压力，进行了玉米愈伤组织对不同浓度草甘膦

5、的抗性实验，确定向培养基中添加浓度为lmM的草甘膦异丙胺盐筛选15天能有效的抑制非转基因玉米愈伤组织的分化，本研究的再生植株的阳性率为45％，为玉米及其它单子叶作物转化提供了一种有效、安全的筛选体系。关键词：抗虫／耐草甘膦；crylAh基因：crylIe基因；2历凹一epsps基因；转基因玉米；筛选AbswactResearchontheInsect·-Resistant／Glyphosate—-TolerantMutipleGeneTransformationinMaizeAbstractMaizeisnotonlythestaplef．00dcrop，butalso锄importantra

6、wmaterialforfeedandindustry,neverthelessthethreatofpe啦andweedsleadstOaseriousdeclineinitsoutputandquality．Thebirthofgeneticengineeringprovidesaneffectiveinca／isforthepreventionandtreatmentofpestsandfeeds．G2-epspsgenewasclonedfromaPsedomonasfluorescensstrednG2isolatedfromanextremelyglyphosatepolluted

7、environment,anditWasanovelgenewhichhasbeenpatented．InordertOimprovetheglyphosate-tOlerant(72一epspsgene’sexpressionlevelintransgenicmaiT豫，thecodonofG2-epspsWaSoptimizedaccordingtotheplant’scodonprefere