总RNA的提取与电泳

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1、实验三动物组织总RNA的提取与电泳四川大学基础医学与法医学院生物化学与分子生物学廖英7/25/202111.实验目的和要求2.相关基础知识3.实验方法、步骤和注意事项7/25/20212一.实验目的和要求掌握RNA制备以及常用鉴定方法的原理、操作步骤、注意事项和技术关键。7/25/20213二.相关基础知识1.RNA的种类和作用细胞内的RNA主要是rRNA、tRNA及mRNA和小分子RNA。rRNA含量最丰富，由2８S、18S、5.8S和5S几类组成。mRNA种类繁多，分子量从数百至数千碱基不等。7/25/20214RNA是基因表达过程中非常重要

2、的生物分子，如mRNA,它携带了DNA的全部编码信息。RNA的分离是研究基因功能的重要基础之一，在分子生物学中占有重要的地位。7/25/202152.应用总RNA制备在分子克隆中有广泛应用，可用于：1Northernblotting2通过Oligo(dT)制备mRNA3通过反转录聚合酶链反应（RT-PCR）建立cDNA文库4用于消减杂交和消减文库的构建，筛选差异表达基因5体外蛋白质的生物合成7/25/20216苯酚法：用SDS变性蛋白并抑制RNase活性，经多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAC和乙醇沉淀RNA；胍盐法：用异硫氰酸胍

3、或盐酸胍和-巯基乙醇变性蛋白，并抑制RNase的活性，经酚氯仿抽提后再沉淀；氯化锂沉淀法：因为锂在在一定pH下能使RNA相对特异地沉淀，但容易使小分子RNA损失，而且残留的锂离子对mRNA有抑制作用。3.常用方法已有多种较为成熟的分离总RNA的方法，常用的有3种:7/25/20217本实验采用胍盐法。其原理是：在解偶联剂异硫氰酸胍作用下，蛋白质与RNA解偶联；利用蛋白质为酚–氯仿–异戊醇变性后可除去；而RNA不溶于50%异丙醇析出得到分离纯化。7/25/20218４．RNA的检测RNA的检测采用琼脂糖凝胶电泳，分为非变性电泳和变性电泳。紫外分光

4、光度法分析所制备RNA的浓度及纯度。7/25/20219由于RNA分子是单链核酸分子，它自身可以回折形成局部双链的二级结构及更复杂的分子状态，所以通过一般传统的琼脂塘凝胶电泳难以得到依赖于分子量的电泳分离条带。为此电泳上样前将样品于65℃加热变性5分钟，使RNA分子的二级结构充分打开，并且在琼脂糖凝胶中加入适量的甲醛，可保证RNA分子在电泳过程中持续保持单链状态。如此，总RAN样品便在统一构象下在琼脂糖凝胶上得到依赖于分子量的逐级分离条带。7/25/202110可通过紫外分光光度法分析所制备RNA的浓度及纯度。浓度：O.D260=1时，RNA为4

5、0μg/ml纯度：O.D260/O.D280≈2.0〈1.75说明存在蛋白质污染〉2.0说明存在酚等有机溶液污染7/25/202111三.实验方法、步骤和注意事项兔肝匀浆液0.5ml至eppendorf中50μlNaAc颠倒混匀0.5ml酚氯仿异戊醇，混匀置冰浴中20min.离心(10000rpm,20min.)吸出水相7/25/202112置-20℃冰箱中RNA使沉淀(1hr)75℅乙醇１ml，混匀离心(10000rpm,10min.)溶解之RNA离心(10000rpm,10min.)沉淀沉淀50μldH2O(DEPC)加入等体积异丙醇水相(R

6、NA)7/25/202113原点28s18s5srRNA1%琼脂糖电泳①制胶②20μl样品液→７0℃，２～３分钟→冷至室温→加４μlloadingbuffer③点样④电泳（电压150V，时间30分钟）7/25/202114由于RNase极稳定，所以，在操作RNA时，要格外仔细，以防RNA被降解。在提取RNA之前，必须对所用器皿进行RNase灭活处理。如用180oC干烤8小时以上处理玻璃器皿，或用0.1的二乙酯焦碳酸(DEPC)的水溶液浸泡玻璃器皿和其它用品。所用水以及相关的缓冲液也需要用0.1DEPC水处理。注意事项１、抑制内源和外源RNas

7、e活性7/25/202115使用RNase抑制剂。细胞内RNase丰富，为防止RNA水解，在制备所使用的试剂，异硫氰酸胍，酚，氯仿，异戊醇，异丙醇，乙醇，DEPC均为RNase抑制剂。所有器皿均需用含DEPC蒸馏水处理后消毒，防止细菌RNase对RNA的水解。潜水电泳槽经3%H2O2浸泡10分钟后用含0.1%DEPC消毒蒸馏水清洗。带手套操作防止细菌及汗液RNase对RNA水解。7/25/202116注意：DEPC有致癌之嫌，必须小心操作，防止接触与吸入！7/25/2021172、组织新鲜，否则液氮冻后-70°冰箱保存。3、低温：为防止RNA降解

8、操作在冰浴或低温中进行。4、制备的RNA-70℃可保存数月。7/25/202118THEEND7/25/202119