蛋白质分离纯化技术

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1、蛋白质分离纯化2009-3-28蛋白质的酸碱性质蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定pH的溶液中都可解离成带负电荷或正电荷的基团。蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。蛋白质的胶体性质蛋白质属于生物大分子之一，分子量范围可达1万至100万之间，其分子的直径在1~100nm，为胶粒范围之内。蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷（双电层）水化膜蛋白质分离纯化的一般原则总目标：增加蛋白制品的纯度或比活1.前处理(pr

2、etreatment)：因动/植物/细菌而异2.粗分级分离(roughfractionation)：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方法3.细分级分离(finefrationation)：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等4.结晶：分离纯化的最后步骤蛋白质的分离纯化方法根据蛋白质分子大小的差异分离—透析和超滤根据蛋白质的溶解度差异分离—沉淀、盐析等根据蛋白质的电荷差异分离—电泳、离子交换等根据蛋白质与某些物质的吸附差异—吸附分离利用生物分子专一性结合的特性—亲和层析透析（dialysis）原理：利用蛋白质分子不能通过半透而将其与小分子物质分开常用的半透膜为

3、玻璃纸或纤维素材料按照分子大小进行分离，分离取决于透析袋截留的分子量。透析——只用来除盐类和小分子杂质超过滤（ultrafiltration）加压蛋白质溶液半透膜支持膜的栅板超滤液原理:是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质留在半透膜上，以达到浓缩和脱盐的目的盐析(saltprecipitation)原理：将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。蛋白质脱去水化层而聚集沉淀盐析－(NH4)2SO4分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中盐溶等电点沉淀

4、和pH控制不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。这样沉淀出的蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。有机溶剂分级分离丙酮、甲醇、乙醇等沉淀:能使蛋白质在水溶液中的溶解度将低。低温（零下40-60度）进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。温度对蛋白质溶解度的影响在一定温度范围内，约0~40℃之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但也有例外，如人的血红蛋白从0~25℃，溶解度随温度上升而将低。在40~50℃以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般在中性pH介

5、质中即失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在0℃或更低的温度下进行。层析也称色谱，基本原理是待分离蛋白质溶液在流动相的带动下经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。层析因固相介质不同又分为离子交换层析、凝胶层析和吸附层析等。层析(chromatography)技术层析的主要设备常见色谱柱自动分步收集器将作为固相成分的不溶性基质，例如葡聚糖凝胶、纤维素、树脂等填充到柱子中，用平衡液平衡。然后加样品，再用适当的溶剂洗脱。样

6、品中各种成分通过柱子取决于与固相成分的相互作用，最后以不同速率被洗脱出来，达到将各个成分分离的目的。凝胶层析亦称凝胶过滤、排阻色谱或分子筛层析等。其机理是分子筛效应，主要根据蛋白质分子的大小进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，凝胶颗粒在合适的溶剂中浸泡，充分吸胀后装入色谱柱内，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱。因此，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。凝胶（gelchromatography）层析♣单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。♣分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部

7、，随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物质迁移速度快；♣小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所以小分子物质迁移速度慢。凝胶过滤层析过程示意图凝胶过滤层析过程示意图优点1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体。其结构稳定，所以凝胶本身不与样品发生化学反应。2.凝胶层析的操作条件较温和，不易引起生物物质的变性，即使用来分离一些理化性质不稳定的物质也很少被破坏。3.样品得率高，重复性好。如果按比例扩大柱的体积和高度，可进行大量样品的分离纯化。缺点1.要求样品和洗脱液的粘度很低