蛋白质的分离纯化技术

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1、蛋白质的分离纯化技术1、根据蛋白质带电性质不同的分离技术1.1离子交换层析以离子交换剂作为柱填充物，在中性条件下，根据由于蛋口质和多肽的带电性不同而引起的离了交换亲和力的不同而得到分离。其可分为阳离了柱和阴离了柱两大类，还有一些新型树脂，如大孔型树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶树脂等。离了交换剂有阳离了交换剂和阴离了交换剂。当被分离的蛋口质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂可交换基团相同电荷的蛋白质被吸附在离了交换剂上，带同种净电荷越多，吸附力越强。随后用改变pH或离子强度的办法将吸附的蛋口质按吸附能力从小到大的顺序

2、先后洗脱下来。1.2电泳法电泳为带电粒了在电场中向与其口身所带电荷和反的电极方向移动的现象。蛋口质混合样品经过电泳后，被分离的各蛋白质组分的电泳迁移率互不相同，由各蛋白质组分所带的静电荷以及分了大小和形状的不同而达到分离。现在常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,可以因不同蛋口质所带电荷的差杲和大小差界高分辨率地分离或分析蛋白质。在PAGE系统中加入十二烷基磺酸钠（SDS）,可以消除蛋口质所带电荷的差异，构成的SDS-PAGE系统是测定蛋口质的相对分子质量最常用的方法。2、根据蛋白质溶解度不同的分离技术2・1蛋白质的盐析蛋口质在低盐浓度下的溶解度

3、随着盐溶液浓度升高而增加，此称盐溶；当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度乂以不同程度下降并先后析出，此称盐析，从而达到分离纯化的效果。2.2有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋口质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中便沉淀析出。近年来的研究认为，有机溶剂可能破坏某种键如氢键，使空间结构发生变化，致使一些原來包在内部的疏水集团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。利用不同蛋口质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度井界而分离的方法即为有

4、机溶剂沉淀法。常用的有机溶剂有乙醇或丙酮。同时，为了防止蛋口质变性，应在低温下沉淀。2.3等电点沉淀法利用蛋口质在等电点时溶解度最低而各种蛋口质具有不同的等电点的特点进行分离的方法。用于提取后去除杂蛋白，通过变动提取液的pH使某些与待提纯的蛋白质等电点相距较大的杂蛋白从溶液屮沉出。但此法很少单独使用，可与盐析法结合使用。3、根据蛋白质分子大小不同的分离技术3.1超滤超滤法是利用高压力或离心力，使用一种特制的薄膜对溶液中各种溶质分了进行选择性过滤，迫使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋口质留在膜上，可选择不同孔径的滤膜截留不同分了质量的蛋口质，以

5、达到浓缩和脱盐的目的。因此根据蛋口质分子大小的不同，选择不同规格的滤膜进行超滤，从而使蛋白质得到分离。3.2凝胶层析凝胶层析法式根据分了大小分离蛋口质混合物最有效的方法Z—。利用有一定孔径的多孔的亲水性凝胶作为载体，当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，直径大丁•凝胶孔径的大分了由丁不能进入胶粒内部，便随着溶剂在胶粒间隙向下移动并最先流岀柱外；直径小于凝胶孔径的分子能不同程度的自由出入凝胶珠的内外。这样不同大小的分了由于所经的路径不同从而得到分离，大分了物质先被洗脱下来，小分子物质后被洗脱下来。常用的填充材料是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶。它是一种快

6、速而简便的分离分析技术，由于设备简单，操作方便，不需要有机溶剂，对高分了物质有很高的分离效杲，因此被生物化学、分了生物学、生物工程以及医药学等领域广泛应用。4、根据配体特异性的分离技术亲和层析利用生物大分子与某些相对应的专一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起來的一种分离生物大分了的色谱方法。这种特异可逆结合的物质很多，如抗原与抗体，底物与酶，激素与受体等。只需要一步处理即可使某种待分离的蛋白质从复杂的蛋口质混合物中分离出來，达到千倍以上的纯化，并保持较高的活性。亲和层析屮一对互相识别的分子互称对方为配体。将称为配体的分子共价结合在层析柱中的固体

7、材料上，混合物流经层析柱时，目标蛋白与配体结合被层析柱中的固体材料截留，而非口标蛋白则不能与层析柱屮的固体材料结合。先洗脱除去杂蛋口，再用含游离配体的洗脱剂将目标蛋白替换卞来，从而达到目标蛋白的分离与纯化。目前亲和层析技术被广泛地应用在蛋口质研究和制备领域，是分离纯化以及分析生物大分子尤其是蛋口质的有力工具。利用该法从粗提液屮经过一次简单的处理便可得到所需的高浓度活性物质。5、根据选择性吸附的分离技术5.1轻磷灰石层析吸附剂疑磷灰右可用于分离蛋白质和核酸。蛋白质屮带负电基团与轻磷灰右晶体表而的钙离子结合，而带正电基团与磷酸基相互作用，径磷灰石对蛋

8、白质的吸附容量比较大。因此，根据蛋白质分了与吸附剂轻磷灰石Z间的吸附能力和解吸性质的不同而达到分离的口的。5.2疏水作用层析根据蛋口质表