密骨胶囊对去卵巢大鼠骨TGFβ1及Fas基因表达的影响

《密骨胶囊对去卵巢大鼠骨TGFβ1及Fas基因表达的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、密骨胶囊对去卵巢大鼠骨TGFβ1及Fas基因表达的影响作者：刘克斌,沈霖单位：华中科技大学附属协和医院中西医结合诊疗中心，湖北武汉【摘要】目的：观察密骨胶囊对TGFβ1及细胞凋亡Fas基因的影响。方法：采用免疫组化染色法分析去卵巢大鼠用密骨胶囊治疗前后骨组织内成骨细胞TGFβ1和破骨细胞Fas抗原表达的阳性率及平均光密度变化。结果：模型组骨组织TGFβ1表达下降，明显低于假手术组（P<0.05）；Fas平均光密度及阳性单位都明显高于假手术组；而密骨胶囊高、低剂量组TGFβ1表达明显上升，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）

2、；低剂量组Fas阳性单位与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05），但Fas平均光密度与模型组比较无统计学差异。结论：密骨胶囊能够使去卵巢骨质疏松模鼠TGFβ1表达明显增强，表明该药治疗骨质疏松疗效机理之一，可能是通过调控TGFβ的合成、分泌而起作用的；骨细胞凋亡活性下降，有利于减缓雌激素缺乏导致的骨量丢失，有利于成骨细胞增殖和分化。【关键词】细胞转化生长因子β1；Fas基因；骨质疏松；密骨胶囊原发性骨质疏松症是一种骨量减少、骨显微结构异常而导致骨脆性增高，易发骨折的代谢性骨病，多发于绝经后及老年人。研究表明，绝经后妇女（包括手术绝经）由于性腺功能

3、衰减退，雌激素分泌不足，可致骨代谢呈负平衡，即破骨细胞的骨吸收活动增加，成骨细胞的骨形成活动相对减弱，这样机体每完成一个骨建周期，将损失一部分骨量，若干周期后，形成骨质疏松症。骨的重建和吸收依赖于破骨细胞，骨的新生和置换依赖于成骨细胞，它们的发育、成熟以及增殖与凋亡受多种基因、激素、生长因子和其它调节因子的控制[1，2]。既往的临床和实验研究证明[3]，补肾中药密骨胶囊可抑制破骨细胞性骨吸收，促进成骨细胞增殖，防治绝经后老年性骨质疏松症。为了进一步研究该药对细胞因子及细胞凋亡基因的影响，本实验采用免疫组化染色法分析了去卵巢大鼠用密骨胶囊治疗前后骨组织内成骨细胞TGFβ1和破骨细胞

4、Fas抗原表达的阳性率及平均光密度变化。1材料与方法1.1材料1.1.1试剂与仪器SABC试剂盒为博士公司产品（编号：SA2042）。DAB显色试剂盒为博士公司产品（编号：ED1022）。TGFβ1、Fas均为SantaCruzBiotechnologyInc.公司产品（批号：201105）。APES为Sigma公司产品。EDTA为Sigma公司产品。切片机（AoScientificInstruments生产）。HH.B11.500恒温箱（上海市跃进医疗器械一厂生产）。加样器、Nikon显微镜和HPIAS1000高清晰度彩色图象分析系统。1.1.2动物3月龄未孕产的雌性SD大鼠

5、57只，体质量220～280g，由同济医学院实验动物中心提供。1.2方法1.2.1实验动物分组及取材实验动物随机分为假手术组（n=9）、去卵巢模型组、密骨胶囊高（4ml/d）、低剂量组（2ml/d）及福善美组（2ml/d）（各组n=12）。用0.05g/ml氯胺酮(100g/kg)腹腔注射麻醉，除假手术组外，其余4组大鼠均行双侧卵巢切除术。切卵巢后12周开始治疗性给药，按体表面积换算大鼠用药量，用0.5%CMC配成悬浊液,连续灌胃12周。大鼠自由摄取标准饲料和蒸馏水，假手术组、模型组灌胃同体积生理盐水。假手术组、模型组在术后12周取材（第5腰椎），剩余各组于术后24周即灌胃12周后取材（第5

6、腰椎）。10%中性福尔马林液4℃固定24h，PBS漂洗，10%EDTA（pH7.2）4℃脱钙10～14d。1.2.2石蜡切片制备将脱钙标本以PBS充分漂洗，按常规逐级脱水、透明、侵蜡。采用APES处理载玻片，捞片后置烤箱60℃30～60min，以使切片紧密粘附。切取5μm厚组织裱于APES包被载玻片上。37℃烤干，-20℃存放。1.2.3免疫组织化学SABC免疫酶标法步骤：①取出切片，风干，常规脱蜡至水，二甲苯Ⅰ，10min；二甲苯Ⅱ，5min。②蒸溜水新鲜配置3%H2O2，室温10min以灭活内源性酶，蒸溜水洗2min×3次。③滴加复合消化液，室温10min。蒸溜水洗2m

7、in×3次。④滴加正常山羊血清，室温10min。甩去多余液体，不洗。⑤分别滴加：兔抗TGFβ1、Fas蛋白的抗体，4℃过夜。0.01MPBS洗2min×3次。⑥滴加生物素化山羊抗兔IgG,20～37℃20min。0.01MPBS洗2min×3次。⑦滴加试剂SABC，20～37℃20min。0.01MPBS洗5min×4次。⑧DAB显色：使用DAB显色