高密度发酵制备重组人金属硫蛋白Ⅲ

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1、109054‘舟娄号；——密衄；——单位代码：!塑!!学号z—20042—0701西北大学硕士学位论文题目：盍厦枉宜矗童廑蕉醛趔盔重堑厶垒厘煎墅自：匹作者：圭一壁．指导教师：主竖生专业技术职务：型垫撬教授答辩日期：2壁垒2生垂．且一学位授予日期：二oO七年五月大肠杆菌高密度发酵制备重组人金属硫蛋白．Ⅲ摘要本文首次对大肠杆菌生产重组人金属硫蛋白-m(rhMT-III)的高密度发酵工艺进行了研究。从发酵培养基、控制溶氧量、补料方式、诱导方法等方面进行了优化。最终在5L发酵罐中，大肠杆菌湿菌重最高可达140g／L，目标融合蛋白约占全菌总蛋白的23％以上。对菌体进

2、行分离纯化，rhMT-III得率约为每升菌液90毫克蛋白，纯度80％以上。论文包括四个部分：1．文献综述首先对金属硫蛋白及金属硫蛋白一m的理化性质、结构特点、生物学功能等方面的研究进行综述；并概述了大肠杆菌高密度发酵的基本情况。最后简述了金属硫蛋白的制备方法及本论文的研究目的和意义。2．重组大肠杆菌摇瓶发酵工艺的研究用单因素实验确定培养基主要成分，并对诱导剂浓度、表达时间及诱导方式等对菌体生长及目的蛋白表达的影响进行了研究。结果表明添加IPTG及乳糖复合诱导的方式是可行的。3．重组大肠杆菌在5L发酵罐高密度发酵工艺的研究以摇瓶发酵的结果为基础，在5L发酵罐

3、中，采用平衡DO-stat法，通过搅拌、通入富氧、控制补料流加、优化诱导时机等方法，实现了大肠杆菌的高密度发酵。碳源为甘油时，在菌体生长的对数中后期加入IPTG诱导，湿菌重最高可达115g几，融合蛋白表达约占全菌蛋白的23．88％。碳源为葡萄糖时，在菌体生长对数中期加入IPTG及乳糖复合诱导的方式，湿菌重最高可达140g／L，融合蛋自表达约占全菌蛋白的23．01％。4．重组入咖的分离纯化及检测高密度发酵所收获的菌体，经超声破碎、亲和层析、凝血酶酶切、分子筛分离等步骤，最终rhMT-m的得率约为每升菌液90毫克蛋白。用ELISA对蛋白纯度进行测定，结果表明蛋

4、白含量在90％以上，DTNB巯基法测得巯基含量与理论值基本吻合．关键词：金属硫蛋白一Ⅲ，重组大肠杆菌，高密度发酵，平衡DO-star法，分离纯化ⅡHighcelldensitycultureoftherecombinanthumanMT．ⅢinEscherichiacoliAbstractInthisthesis，thehighcell--densityfermentationtechnologyofrecombinanthumanmetallothionein-III(rIlMT．Ⅲ)inEscherichiacoliwasresearchedforth

5、efirsttime．Conditionssuchasmediumcomponents，dissolvedoxygenconcentration,fed-batchcultivation,inductionmodelsandSOonwereoptinaized．Finally,wetcellweightofrecombinantEscherichiacoliin5Lfermenterwasasllighas140g，L．TheexpressionofGST-MT-ⅢintotalsolubleproteinsWasover23％．n坞recombinant

6、proteinoffhMT．ⅢWaspurified．TheyieldofrhMT^IⅡWas90mg／Land．t11epurityreachedover80％．111ethesisincludesthefollowingfourparts：1．ReviewAtfirst，theresearchesaboutthephysieoehemiealproperties，structurecharacterizatiom．biologiealfunctionsofMTandMT-Ⅲwereintroduced．Thenthefundamentalknowled

7、geofhighcelldensitycultureofEscherichMcoilWasreferred．AtlastthepreparationmethodsofMTandtheaimandvalueofthisthesisWel-ealsobrieflyreviewed．2．Thefermen纽tionofrecombiaantEseherichiacoilinshakeculturen把marecomponentsofmediumwereopfunizedwithsinglefactorexperimenLTheinfluenceonthecell

8、growthandtheexpressionoffusionpro