细胞培养手册

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1、CHO细胞无血清培养基技术手册1CHO细胞CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞(ChineseHamsterOvary，CHO)，1957年美国科罗拉多大学Dr.TheodoreT.Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是目前生物工程上广泛使用的细胞系。工业生产上应用较多的是CHO-K1细胞，为转化细胞系，细胞染色体分布频率是2n＝22，系亚二倍体细胞。ATCC保存CHO-K1细胞株，编号为CCL-61，被广泛地用于重组DNA蛋白的表达。由于该细胞存在遗传缺陷，无脯氨酸合成基因，不能将谷氨酸转变为谷氨酸-γ-半醛，培

2、养过程中需在培养基中添加L-脯氨酸才能生长。并且由于该细胞已经霍乱毒素适应，形态学有所改变。最初细胞为贴壁型细胞，经多次传代筛选后，也可悬浮生长。ATCC提供的CHO-K1细胞照片CHO细胞容易发生基因突变，也较易进行基因转染，是良好的哺乳动物基因表达宿主细胞，代表性细胞有二氢叶酸还原酶（dihydrofolatereductase）营养缺陷型突变细胞株（CHO/dhfr-）、转染谷氨酰胺合成酶（Glutaminesynthetase,GS）基因的GS-CHO细胞。二氢叶酸还原酶是真核细胞核苷酸生物合成过程中起着重要作用的一种

3、酶，是常用的遗传选择标记之一，它可催化二氢叶酸还原成四氢叶酸。对于dhfr突变体细胞而言，由于不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代谢途径，因此不能在常规培养基上生长，但若在培养基中加入次黄嘌呤（hypoxanthine）和胸苷（thymidine），则突变体细胞可以借助核苷酸的补救合成途径维持生长。利用dhfr基因进行筛选时，首先将重组DNA分子导入dhfr- 表型的受体细胞，然后撤除原培养基中的的次黄嘌呤和胸苷，即可获得dhfr+并能表达外源基因的克隆细胞系。因此在挑选表达外源基因的阳性克隆细胞时需选用不含次黄嘌呤和胸苷的培

4、养基。另外，氨甲喋呤（MTX）选择压力可使CHO/dhfr- 细胞的外源基因的拷贝数扩增并得到较高水平的表达。CHO-GS细胞是用含单抗蛋白等的目的基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因标记的表达载体，转染宿主细胞CHO，再通过L-氨基亚砜蛋氨酸(methioninesulphoximine，MSX)等化合物选择加压促使GS基因和目的蛋白基因扩增，筛选获得重组细胞株，可在不含谷氨酰胺培养基中生长、增殖，可避免或减少细胞代谢过程中谷氨酰胺降解积累的氨对细胞的损伤、抑制作用。ATCC提供的CHO/dhfr-细胞照片2CHO细胞表达系统的

5、优势与特点由于哺乳动物细胞结构、功能和基因表达调控的复杂性，外源基因在哺乳动物细胞中的表达与在原核生物中的表达存在较大差异，因而外源基因在哺乳动物细胞中高效表达所需的元件也不同于在原核生物细胞中的表达所需的元件。外源基因在哺乳动物细胞中的表达包括基因的转录、mRNA翻译及翻译后蛋白质的加工等过程，如蛋白质的糖基化、磷酸化、寡聚体的形成以及蛋白质分子内或分子间二硫键的形成等比较复杂，要表达具有生物学功能的蛋白质如膜蛋白、抗体和具有特异性催化功能的酶需要在哺乳动物细胞中进行。哺乳动物基因表达宿主细胞选择的基本原则是来源丰富、转化效

6、率高、表达效果好，CHO细胞作为表达系统除具有上述的特点要求外，还有以下优势： 1）外源基因被整合到宿主染色体上后，在没有选择压力的情况下能稳定保持； 2）适合多种蛋白质的分泌表达和胞内表达，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化； 3）对培养基的要求较低，可在无血清培养基中培养； 4）细胞可进行贴壁培养也可进行悬浮培养，且具有较高的耐受剪切力和渗透压能力； 5）可进行高密度大量培养，进行较大规模生产时其培养量可放大到20000L以上，是目前应用最广泛的哺乳动物基因表达受体细胞之一。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子I

7、GF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在无血清培养基（SFM）中生长良好。3CHO细胞在生物制药中的应用目前已有多种外源基因如人组织性纤溶酶原激活剂（tPA）、人促红细胞生成素（EPO）、乙肝表面抗原（HBsAg）、干扰素γ（IFNγ）、干扰素β（IFNβ）、白细胞介素2（IL2）、凝血因子Ⅷ等在CHO细胞中得到表达。在美国已注册的大约73种蛋白药物生产中，应用哺乳动物细胞培养的有35种，CHO细胞培养的就占27种，其中包括10种单克隆抗体。下表是以C

8、HO细胞培养为基质生产的重组制品。4无血清细胞培养基无血清培养基的出现是培养基发展历程上的一个里程碑，其一般是在合成培养基的基础上，引入成分完全明确的或部分明确的血清替代成分，使培养基能满足动物细胞培养的要求，又可有效的克服因使用血清所引发的问题。进入20世纪80年代后，新的