ET系统_原核表达详细总结

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1、PET原核表达系统pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。目的基因被克隆到pET质粒载体上。受噬菌体T7强转录及翻译信号控制，表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。T7RNA聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白。不依赖连接反应的克隆方法（LIC）用LIC法制备的pET载体有不互补的单链粘端，与目的插入片段上相应的粘端互补。扩增目的插入片段的引物5,端序列要与LIC载体互补。T4DNA聚合酶的3,-5,外切酶活性经短时间

2、即可在插入片段上形成单链粘端。由制备好的插入片段和载体互相形成退化产物，这种方法十分快速高效且为定向克隆。pET载体上编码的氨基酸序列可通过肠激酶或X因子去掉。FunctionofT7PolymeraseThe3'®5'exonucleaseactivityofT4DNApolymeraseremovesnucleotidesuntilitencountersaresiduecorrespondingtothesingledNTPpresentinthereactionmix.Atthispoi

3、ntthe5'®3'polymeraseactivityoftheenzymecounteractstheexonucleaseactivitytoeffectivelypreventfurtherexcision.pET载体pET载体最初是由Studier及其同事构建。(StudierandMoffatt,1986;Rosenbergetal.,1987;Studieretal.,1990).包括两种载体——转录载体（用于表达本身含有核糖体结合位点和起始密码子目的基因）和翻译载体（载体上带有核

4、糖体结合位点）。一般来说，转录载体用于表达来自原核的基因，而翻译载体表达真核基因。抗生素抗性pET载体常用的两种筛选标记是Ampr+和Knar+因为内酰胺酶的消化和PH的降低，Ampr+的选择性易于丢失。某种情况下使用Knar+更为有利。Ampr+和Knar+的另一个不同是两种基因的转录方向不同。Ampr+位于T7启动子下游，与其方向相同。除了pET5系列，T7转录终止序列位于内酰胺酶基因前面，但是这个终止序列只有70%的有效性。因此，T7聚合酶能够通读，导致内酰胺酶的积累。相反Knar+的转录

5、方向与T7启动子方向相反，诱导时并没有Knar+基因的增加。用于克隆的宿主菌用于克隆的宿主菌通常是Novablue，JM109以及DH5a。这些菌株是rec-end-型，转化效率高，且质粒产量也高，适合用于保存带有克隆目的基因的PET载体。用于表达的宿主菌BL21(DE3)基因型：F–ompThsdSB(rB–mB–)galdcm(DE3)无抗性重组质粒转化到带有T7RNA聚合酶基因的大肠杆菌中，即可开始产生蛋白了。这些菌株都是DE3溶原菌。噬菌体DE3是一种衍生噬菌体，带有噬菌体21抗性区和l

6、acI基因，lacUV5启动子，以及T7RNA聚合酶基因。这一区段被插入int基因，因此阻止了DE3在没有辅助噬菌体时整合到染色体上或从染色体切出，一旦形成DE3溶原状态，就只有受IPTG诱导的lacUV5启动子指导T7RNA聚合酶基因转录。BL21(DE3)BL21(DE3)是应用最广泛的表达宿主菌。是lon蛋白酶和ompT膜外蛋白酶（纯化过程可以降解蛋白）缺陷型。目的蛋白BL21中更加稳定。因为BL21(DE3)对利福平敏感，如果有必要可以用利福平来限制宿主RNA和蛋白质的背景合成。应该注意

7、一些带有T7启动子的商业载体原则上可以用来表达，然而，只有T7启动子而没有额外的lac阻遏子基因的载体并不适合。这些载体上的多拷贝lac操纵子（用于蓝白斑筛选）会结合lac抑制因子，使pet菌株中同样受lac抑制因子控制的基因部分表达。。结果基本的T7RNA聚合酶活性升高，使目的基因的稳定性受到影响。lacUV5Promoter与野生型lac启动子相比，控制T7RNA聚合酶表达的lacUV5启动子对cAMP/CRP的刺激并不敏感。然而，最近研究发现rDE3宿主菌在缺少葡萄糖的培养基生长到稳定期时

8、，cAMP同样对lacUV5产生了去阻遏作用。尽管宿主菌长到稳定期并不推荐，菌体培养过夜（16h）后转入含有1%的葡萄糖的培养基中，可以有效避免去阻遏作用，因为glucose可以cAMP的产生。T7lacPromoterT7启动子下游有个Lac启动子，它包含常规的启动子和lacI基因，T7lac与lacI启动子位置交错。采用这种载体及DE3溶原菌，lac阻遏蛋白可以作用与T7RNA聚合酶，也作用与载体T7lac启动子。阻断任何T7RNA聚合酶导致的目的基因转录。pLysS和pLysE宿主菌另一个