原核表达及纯化总结

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His标签重组蛋白大量表达及纯化一筛选及鉴定1将构建好的连接产物进行转化DH5α鉴定表达载体和目的片段的连接一般为10µL连接体系，此步转化方法如下：取100µLDH5α感受态细胞，加入到10µL连接产物体系中↓冰上放置30min↓42℃准确热激90秒↓冰上放置3min↓加入300µL无Amp+的LB培养基，37℃100rpm/min振荡培养1h↓将400μL菌液全部涂LB平板（含Amp+）水平放置30min待菌液完全吸收后，在37℃温箱中倒置培养过夜（12~16h），直至出现单菌落。2阳性克隆的PCR鉴定方法如下挑取单菌落于200μL含Amp+LB培养基中（用2.0的离心管），摇床200rpm/min，37℃培养4h，待菌液浑浊后，取1μL做菌液PCR鉴定。PCR扩增体系如下：取1μL菌液作为模板反应体系如下：模板1µL10×PCR反应缓冲液（含Mg2+）2µLdNTP(2.5mmol/L/each)1.6µL上游引物（10µmol/L）1µL下游引物（10µmol/L）1µLTaq酶（5U/µL）0.3µLddH2O13.1µLTotal20µL条件：94℃预变性10min94℃变性45s 50℃退火45s72℃延伸1min，30个循环的扩增反应72℃延伸10min4℃∞1%琼脂糖凝胶电泳检测：电泳上样时：MarkerDL2000上样3µL样品（1µLloadingbuffer+6µLPCR产物混匀上样）100V，20min；紫外透射仪检测，出现目的带的对应菌落为阳性克隆。（注意：记得保存菌种）3阳性克隆质粒抽提取阳性克隆菌液200µL，加3ml含Amp+LB液体培养基，37℃200rpm/min培养3-4h，待菌液浑浊后，进行质粒抽提。质粒抽提方法如下：取1.5mL菌液于1.5mL离心管中↓12000rpm离心30s，弃上清↓加800μLSTE悬浮沉淀↓12000rpm离心30s，弃上清↓重复STE漂洗沉淀的过程↓加入100μL预冷的solutionⅠ，强烈振荡混匀↓温和加入200μLsolutionⅡ（solutionⅡ现用现配），盖紧管口快速颠倒5次，放置冰上2min至溶液清亮而粘稠↓极温和加入150μL预冷的solutionⅢ，倒置温和振荡10s，冰上放置5min↓12000rpm离心5min↓取上清（400μL），加入等量的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀↓12000rpm离心5min ↓取上清（350μL），加入1/10体积（35μL）的NaAc（3M）和2倍体积预冷的无水乙醇（700μL）上下颠倒5次，（无水乙醇在-20℃保存）↓室温放置20min（-20℃沉淀效果更好）13000rpm离心10min↓弃上清（小心倒出），用1ml70%的乙醇贴壁冲洗漂洗沉淀↓13000rpm离心10min室温放置让乙醇挥发干净↓用20μlTE溶解质粒DNA，每20μL体系中加入1μL1mg/mL的Rnase，37℃作用30min，1%琼脂糖电泳定量检测纯度所用试剂：1、STE：0.1mol/LNaCL10mmol/LTris-HCL(pH8.0)1mmolol/LEDTA2、solutionⅠ：50mmolol/LGlucose25mmolol/LTris-HCL（pH8.0）10mmolol/LEDTA(pH8.0)3、solutionⅡ：0.2mol/LNaOH1%SDS4、solutionⅢ：5mol/LKAc60mL冰醋酸11.5mL无菌水28.5mL(最终K+的浓度为3mol/L，Ac-的浓度为5mol/L)4BL21的转化及诱导表达质粒转化BL21感受态细胞方法如下：取100µLBL21感受态细胞，加入1µL质粒↓冰上放置30min↓42℃准确热激90秒↓冰上放置3min ↓加入900µL无Amp+的LB液体培养基，37℃100rpm/min振荡培养1h↓取100μL菌液全部涂LB平板（含Amp+）水平放置30min待菌液完全吸收后，在37℃温箱中倒置培养过夜（12~16h），直至出现单菌落。5目的蛋白的诱导表达挑取单克隆菌落于3ml的LB液体培养基（含Amp+）中180rpm/min，37℃培养。待菌液浓度OD600≈0.6时开始诱导：1.首先取出50µL菌液留样2.1:1000向剩余菌液中加0.8M的IPTG3µL3.30℃180rpm/min诱导4h收菌6目的蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定1.取700μL菌液13000rpm离心1min，弃上清2.空菌对照及marker3.加30μLPBS和30μL2×SDS上样缓冲液，用枪吹匀4.沸水煮10min，稍离心，将液体汇聚管底，取10µL上样12%的胶浓缩胶90V10min分离胶160V50min考马斯亮蓝染色30min脱色液脱色二大量诱导表达1．取300μL菌液，加入到50mLLB液体培养基（含Amp+）中180rpm/min37℃过夜2．将50ml菌液全部加入到500mlLB液体培养基（含Amp+）中200rpm/min，37℃，大约2h左右，此时OD600约等于0.6开始诱导3.1:1000向剩余菌液中加0.8M的IPTG550μL诱导条件：30℃180rpm/min诱导时间：4h收菌（取700μL留样电泳分析，是否表达出来及表达位置和表达量）三细胞裂解1.将550ml菌液，收菌前准确称出瓶中（为计算湿菌重量）2.分三次，4800rpm/min离心20min，在用PBS洗涤一次，倒置用滤纸控干3.称全重，计算出湿菌重量4.每克湿菌加5mlLysisbuffer（Tris：50mMNacl：300mMPH:8.0）混匀转移到50ml管内5.每毫升菌液加1:500加0.1MPMSF 1.加入终浓度为1mg/ml的溶菌酶E，玻棒搅动20min2.-80℃反复冻融3-5次（冰水混合物中融化）3.每克湿菌加4mg脱氧胆酸（脱氧胆酸先用1mlLysisbuffer溶解），取样30μL准备电泳分析（玻璃棒37℃水浴中搅拌30min，此步骤若是不可溶性蛋白可这样处理，若是可容性蛋白可在冰水混合物中搅拌）4.用注射器在冰水混合物中反复吹吸，使菌液不再成团，变得更加粘稠5.超声20min（每次超声不得超过30s）6.加终浓度5μg/ml的DNaseⅠ和RNaseA及终浓度10mM的CaCl2和MgCl27.室温摇床作用30min，注射器反复吹吸8.补加一倍体积的LysisBuffer，同时加终浓度为1%的曲拉通。（平时常温曲拉通储存液浓度为20%，否则不宜溶解）9.反复吹吸10.13000rpm/min20min11.上清补加PMSF(1:500)沉淀用bufferB溶解同样补加PMSF(1:500)BufferB：NaH2PO420mMNacl500mMUrea8MPH:8.0BufferC:NaH2PO420mMNacl500mMUrea8MPH:6.8（不含咪唑，咪唑现用现加，终浓度10mM）咪唑2M（2M咪唑分装-20℃保存）BufferD：NaH2PO420mMNacl500mMUrea8MPH:8.0(咪唑终浓度100mM)分析：上清及沉淀还有样品处理前的留样，进行电泳分析鉴定目的蛋白是可溶的还是不可溶的以便选择纯化方式四His标签蛋白纯化（可溶和不可溶性）可溶性蛋白纯化（上样前要将上清过0.22μm的滤膜）1）washbuffer平衡柱子（不含咪唑）流速1ml/minwashbuffer：NaH2PO450mMNacl300mMPH:6.8过滤0.22μm除气2）上样流速0.3ml/min（注意蛋白浓度不宜过高，蛋白总量不得超过柱子载量）接一次流穿液，（取样电泳）流穿液也再过一次柱子，接二次流穿液，留样电泳一般可溶性蛋白：过一次柱子就可以将目的蛋白完全吸附，这与柱子有一定关系，第一次操作，最好将一次流穿液再过一便柱子。3）washbuffer（含20mM咪唑）洗脱杂蛋白0.8ml/min，洗脱至少100ml，直到蛋白吸收曲线变平为止（取30μL电泳分析）4）Elutionbuffer洗脱目的蛋白（含250mM咪唑）Elutionbuffer：NaH2PO450mMNacl300mMPH:8.0过滤0.22μm除气流速0.3ml/min收集蛋白收集峰值每管2ml5）washbuffer平衡柱子（不含咪唑）流速1ml/min6）保存柱子时用20%酒精，4℃7）对纯化的样品电泳分析纯度，紫外分光度法定量蛋白浓度（mg/ml）=1.45×OD280-0.74×OD260蛋白1:1000分别加入：0.1MPMSF0.5MEDTA100×PH:7.5（即储存液为100×，加入终浓度为1×） 5ML-Arginine100×PH:7.5（即储存液为100×，加入终浓度为1×）分装-20℃保存不可溶性蛋白纯化1）沉淀用30mlbufferB溶解后，13000rpm离心15min上清过0.22μm的滤膜2）BufferB平衡柱子（不含咪唑）流速1ml/minBufferBNaH2PO420mM；Nacl500mM；Urea8M；PH:8.03）上样流速0.3ml/min（注意蛋白浓度不宜过高，蛋白总量不得超过柱子载量）接一次流穿液，（取样电泳）流穿液重复3-4次过柱子每次的流穿液都要留样电泳分析不可溶性蛋白一般浓度较高，一次不能让柱子充分吸附，所以流穿液重复上样4）BufferC洗脱杂蛋白，流速0.8ml/min，洗脱至少100ml，直到蛋白吸收曲线变平为止，可用考马斯亮蓝G-250监测BufferCNaH2PO420mM；Nacl500mM；Urea8M；PH:6.8（含咪唑终浓度10mM），一般咪唑现用现加，配好的2M咪唑分装-20℃保存5）BufferD洗脱目的蛋白（含100mM咪唑）流速0.3ml/minBufferD：NaH2PO420mM；Nacl500mM；Urea8M；PH:8.0(咪唑终浓度为100mM)6）收集目的蛋白，收集峰值，2ml/管7）蛋白跑电泳分析，含目的蛋白的管子合在一起，透析复性。1）BufferB平衡柱子（不含咪唑）流速1ml/min2）保存柱子时用20%酒精，4℃不可溶性蛋白复性1）根据蛋白分子量大小，选择合适的透析袋水煮30min-1h2）检查透析袋是否漏，将蛋白装入透析袋中透析，透析每12h换一次透析液具体操作：6MUrea→4MUrea→2MUrea→refoldingbuffer1→refoldingbuffer2→pbs1→pbs2→pbs3→pbs4refoldingbuffer:50mMTris；pH7.90.5mMEDTA50mMNaCl5%glycerol磷酸盐缓冲溶液（PBS）溶液【配制方法】　　在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4，用HCl调节pH值至7.4，加水定容至1L，高压下蒸气灭菌20min，保存于室温。注：pbs4中加入了30%PEG20000此步透析中要格外小心，时刻关注不要有蛋白析出（肉眼可见白色析出的沉淀），达到一定浓度时就停止浓缩，亦可根据pbs3时的蛋白浓度及体积，推算合适的pbs4蛋白浓度及体积，及时停止浓缩。将浓缩后的蛋白12000rpm离心上清用分光光度法定量记得补加0.1MPMSF0.5MEDTA100×PH:7.5（即储存液为100×，加入终浓度为1×）5ML-Arginine100×PH:7.5（即储存液为100×，加入终浓度为1×） 分装-20℃保存。至此蛋白纯化及表达工作全部介绍完毕，，全是经验之谈，请大家指证批评，谢谢！