蛋白及其抗体制备的综合实验综述

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1、综述蛋白及其抗体制备的综合实验一．简述IgG的基础理论与临床应用价值.免疫球蛋白的基本结构Ig分子的基本结构是对称的四条多肽链，即两条相同的轻链（L链）和两条相同的重链（H链），借链间二硫键连结而成“Y”字型单体分子.IgG是生物体液内主要的Ig，约占血液中Ig总量的70～75%。由于IgG能通过胎盘，所以新生儿从母体获得的IgG在抵抗感染方面起重要作用。婴儿出生后2～4周开始合成IgG，8岁以后血清中IgG可达到成人水平。由于IgG较其他类Ig更易扩散到血管外的间隙内，因而在结合补体、增强免疫细胞吞噬病原微生物和中和细菌毒素的能力方面，具

2、有重要作用，能有效地抗感染，这是对人体有利的一面。但某些自身免疫病，如自身免疫性溶血性贫血、血小板减少性紫癜、红斑狼疮以及类风湿等中的自身抗体都是IgG。二．简述蛋白质分离纯化原理蛋白质的结构和功能的多态性，比如等电点差别，可以电泳分离；利用分子质量及分子大小，可用分子筛原理，凝胶层析；利用特异性亲和，离子交换层析；或沉降系数，进行离心；或者溶解度不一而进行盐析。所有的方法根本上利用的就是蛋白质结构和功能上的差异。如氨基酸排列，二级结构，三级结构等。三．简述机体抗体产生的机制和生物学意义机制：抗原初次出现在机体内，被机体免疫系统识别，激活免

3、疫系统，进行抗原的吞噬，暴露相关的抗原决定簇，并提呈到B淋巴细胞，刺激使其分化，一部分成为浆细胞，产生相应的抗体，中和体内抗原，另一部分分化成为记忆B细胞，当相同的抗原再次进入机体，可以迅速增殖分化成相应的效应B细胞，生成大量抗体，产生更强烈的免疫反应。意义：1抵御外界抗原的入侵。2清除机体内的变异细胞。四．简述抗体鉴定有关理论抗体具有特异性，能和相应的抗原结合，起抗原-抗体反应。免疫火箭电泳法、单向扩散法、免疫电泳法、ELISA法、免疫透射比浊法和放射免疫沉淀法。都是以这个原理为中心的。只是显示系统有所差别。五．论述免疫散射比浊法原理及其

4、实际应用价值一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液使遇到抗原抗体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射，发生偏转，光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物颗粒大小和多少密切相关。散射光的强度与复合物的含量成正比，即当抗体过量时，待测抗原越多，形成的复合物也越多，散射光也越强。散射光的强度还与各种物理因素，如加入抗原或抗体的时间、光源的强弱和波长、测量角度等密切相关。散射比浊法又分为速率散射比浊法和终点散射比浊法。应用：用于检测血浆、体液中的特定蛋白系列，如免疫球蛋白、补体、血浆蛋白如前白蛋白，白蛋白，等。还可对特定蛋白成分进行定量检测。六．评价这次

5、实验教学的安排和学习方法的科学性本次实验教学，跨度时间长，抗体的制备，对动物的免疫，抗体的鉴定等，让我们有相当多的动手机会，通过本次实验，加深了对机体免疫行为的认识，并也深刻理解了抗体抗原的相关理论知识，让我们在实验中学到了更多。七．实验部分抗原免疫动物产生的抗体是血清γ-球蛋白的一部分。γ-球蛋白是一组结构相似，但又有差异的蛋白质，通称为免疫球蛋白，按其结构和免疫化学性质的差异，又可分为五类，分别称为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE,抗体以IgG最为稳定。因蛋白在体液中含量不同以及分离纯化的难易的差别，可分别采用多克隆抗体制备法和单

6、克隆抗体制备法。一．目的本实验主要以临床检验应用为目的，培养学生的综合分析和实际操作能力。二.蛋白质提取纯化(纯化ApoB为例)1,提取采人外周血液(不抗凝)，离心得血清，用半饱和硫酸铵沉淀球蛋白，弃上清，留沉淀（球蛋白部分）2,纯化上柱层析，分部收集，浓缩，冰冻干燥，－80℃保存3,鉴定(1)电泳，观察每组份电泳带，若为单一带即为免疫纯。(2)估价分子量，通过SDS-PAGE估价分子量(3)pI测定，通过等电技术测定pI(4)氨基末端分析（C-末端，N-末端）(5)用已知抗体进行免疫鉴定三.抗体的制备1．多克隆抗体的制备(1)抗原：目前所

7、知的蛋白进入异种机体后，能致敏淋巴细胞，与抗体产生特异性结合复合物，即具备有抗原性。抗原性包括免疫原性和抗原特异性两方面的含义。具备抗原特异性和免疫原性的蛋白称为完全抗原，大多数动物的免疫系统是非常敏感的，用于免疫的抗原仅需要极微量。抗原应该是纯化品，该纯品在12.5％的PAG电泳后，仅出现一条区带，即认为可用于免疫抗原纯品。先用大白兔，为批量生产，以后采用山羊或绵羊。(2)佐剂：佐剂是指与抗原混合注入机体后，能增加抗原的免疫性或者能改变免疫反应类型的一种物质。人们公认的佐剂是福氏佐剂(Freund’adjuvant)，具有明显的免疫刺激作

8、用。福氏佐剂又可分为两种，即不完全佐剂和完全佐剂，属于一种油包水的乳剂，由羊毛脂或甘露糖醇单油酸酯为乳剂。油包水乳化剂有助于促进免疫反应的进行，还可起部分保护不稳定抗原的作用，使