ApoB及其抗体制备综合性实验

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1、ApoB及其抗体制备综合性实验ApoB及其抗体制备综合性实验200631800112温生超抗原免疫动物产生的抗体是血清丫-球蛋口的一部分。丫-球蛋口是一组结构相似，但又有差杲的蛋白质，通称为免疫球蛋白，按其结构和免疫化学性质的差杲，又町分为五类，分别称为IgG、IgA、TgM、IgD和IgE,抗体以IgG最为稳定。因蛋白在体液中含量不同以及分离纯化的难易的差别，可分别采用多克隆抗体制备法和单克隆抗体制备法。一.冃的本试验主要以临床检验应用为目的，培养学生的综合分析和实际操作能力。二.蛋白质捉取纯化(纯

2、化ApoB为例)1,提取采人外周血液(不抗凝)，离心得血清，用半饱和硫酸镀沉淀球蛋门，弃上清，留沉淀(球蛋白部分)2,纯化上柱层析，分部收集，浓缩，冰冻干燥，一80°C保存3,鉴定(1)电泳，观察毎组份电泳带，若为单一带即为免疫纯。(2)估价分了量，通过SDS-PAGE佔价分了量(3)pl测定，通过等电技术测定pl(4)氨基末端分析(C-末端，N-末端)(5)U知ApoB抗体进行免疫鉴定三.抗体的制备1.多克隆抗体的制备(1)抗原：冃前所知的载脂蛋白进入异种机体后，能致敏淋巴细胞，与抗体产生特异性结合

3、复合物，即具备有抗原性。抗原性包括免疫原性和抗原特异性两方面的含义。载脂蛋口因具备抗原特异性和免疫原性，因此可称为完全抗原，大多数动物的免疫系统是非常敏感的，用于免疫的抗原仅需要极微量。抗原应该是纯化品，该纯品在12.5%的PAG电泳后，仅出现一条区带，即认为可用于免疫抗原纯品。先用人口兔,为批量生产，以采用山羊或绵羊(1)佐剂：佐剂是指与抗原混合注入机体后，能增加抗原的免疫性或者能改变免疫反应类型的一・种物质。人们公认的佐剂是福氏佐剂(Freund"adjuvant),具有叨显的免疫刺激作用。福氏佐

4、剂乂可分为两种，即不完全佐剂和完全佐剂，属于一•种油包水的乳剂，由羊毛脂或廿露糖醉单油酸酯为乳剂。油包水乳化剂有助于促进免疫反应的进行，还可起部分保护不稳总抗原的作用，使抗原在体内的吸收期延氏，从而减少加强注射的次数。在不完全佐剂内加入杀死的分枝杆菌(如结核杆菌或卡介苗)制备成完全佐剂。分枝杆菌能增加局部淋巴结的炎症反应，扩人免疫原性，从而促进最终高亲和力抗体的形成。佐剂有成品购买，也可白行制备。佐剂制备方法是，取石蜡油6份、羊毛脂4份，再加5份不含抗原的抗原缓冲液(含0.1%SDS),混匀，灭菌，分

5、装于小玻璃瓶中，0—8°C保存，此为不完全全佐剂。在不完全佐剂中加入卡介苗(3—5nig/0.5m1)即为完全佐剂，均贮存于0—8°C。临用时，取完全佐剂3份加入含抗原的缓冲液1份，混匀，振摇或研磨，使其成为乳化状态，因为含有SDS很易促使其乳化成油包水抗原乳化复合物。注射入动物体内时一•定要保持乳化状态。抗原用量视抗原分子量不同及免疫原性及免疫动物不同而有一定差异，无统一标准和固泄模式。一般是每兔(约2kg重)或每羊(约20kg重)第1次注射抗原lmg,以后逐次增加抗原量，最多每次不超过3mg。(2

6、)免疫途径及方法：免疫部位町分别选用皮内、皮下或淋巴结。第1次免疫采用皮内结合皮下多点注射，常注射在背部或腿部。许多作者介绍在后足皮下或皮内注射，因为四足落地的关系很易造成感染，使第1次免疫失效，并使动物行走不便，造成伤害。整个免疫过程以2-3个月为宜。一般是第1次免疫后的3-4周再进行第2次免疫，不完全佐剂为乳化剂，2周后加强1次(不完全佐剂)，2周后又加强1次(不完全佐剂或完全佐剂),1周后再免疫1次。待最后一次免疫后的7—10犬，取静脉血测试抗体效价(试血)，效价达到要求后即可一次性放血，采用颈

7、动脉放血，得抗血清。(3)抗血清的获得与保存：免疫成功的动物放血过程，所有用具均严格消毒，并按无菌操作方式进行放血。抗血清的防腐剂以0.05%叠氮钠为宜,也可采用加入20%~30%无菌LT油保存的方法。若时间较氏，不用可采用一20°C低温保存。一般在0—8°C保存1年，抗体效价几乎无改变，保存2年，其效价稍冇降低。抗体切忌反复冻融，否则抗体效价很快降低，以颈动脉一次性放血为宜。(4)单-克隆抗体的制备：单-克隆抗体是一种高度特异性的抗体。单-克隆抗体与多克隆抗体有一定的差别。单克隆抗体在腹水中含量较高

8、，可以人T培养，专一性强等特性是多克隆抗体无法比拟的优点。一.抗体的鉴定：(具体操作详见P4-6)抗体检测可分别采川免疫火箭电泳法、单向扩散法、免疫电泳法、ELISA法、免疫透射比浊法和放射免疫沉淀法。1.免疫扩散法将均匀地混合制备0.8%琼脂糖凝板，呈三角形打三个孔，分别加样人ApoB、抗人ApoB血清、人全血清于三孔内，水平置于37°C温箱内扩散，观察白色沉淀线。2.免疫电泳扩散法制备10x6cm琼脂糖胶板，沾横轴方向间隔打三个孔，挖二条小槽，于孔内