大肠杆菌甲羟戊酸途径的构建与调控

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1、山东大学硕士学位论文大肠杆菌甲羟戊酸途径的构建与调控姓名：张园园申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：祁庆生20090510山东大学硕士学位论文摘要甲羟戊酸是大多数真核生物和高等植物细胞中普遍存在的一种重要的有机酸，是甲羟戊酸途径(MVApathway)的中间产物。甲羟戊酸在高等动物体内的浓度可以指示固醇的含量水平；在合成有价值的萜类物质的发酵培养基中添加甲羟戊酸可成倍的提高萜类产量；此外它在化工行业也有重要的用途，这使得对甲羟戊酸，尤其是天然R型的甲羟戊酸的需求大大增加。而常见的化学合成法，酶催化法合成具有原料难得、结构复杂、

2、成本较高，不适于大规模生产，合成的甲羟戊酸多为外消旋混合物等缺点，因此利用生物体合成甲羟戊酸成为发展趋势。大肠杆菌作为一个成熟的遗传操作系统成为首选宿主，而且大肠杆菌不能利用甲羟戊酸，更有利于甲羟戊酸的生产。甲羟戊酸途径是大多数真核细胞，少数原核细胞和高等植物合成异戊二烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的经典途径，IPP和DMAPP是萜类合成的前体物。另外有一条新发现的1．脱氧．D．木酮糖．5．磷酸途径(DXPpmhway)，存在于多数真细菌和高等植物细胞中，也是生物合成萜类前体的途径。本课题将来源于粪链球菌的MV

3、A途径的mvaS，mvaE，mvaKl，mvaD，mvaK2五个酶基因通过质粒克隆到大肠杆菌体内。MVA途径的上游基因mvaS，mvaE和下游基因mvaKl，mvaD，mvaK2分别克隆到两个相互兼容的载体上，得到质粒pZYSE和pZYKDK。同时，使用定点突变的方法，将3．羟基．3．甲基．戊二酸单酰辅酶A合酶(HMGS)中110位的丙氨酸突变为甘氨酸的时候，可以将HMGS的酶活提高140倍。在此基础上克隆3．羟基．3一甲基．戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)基因，得到载体pZYSE，DH5aAptsG／pZYSE发酵结果在GC检测

4、色谱图上有新的峰出现，经标准品证实为甲羟戊酸，产量为168mg／L。经过代谢调节，使用基因敲除手段，将磷酸转运系统的ptsG基因，催化丙酮酸，乙酰辅酶A转化为副产物乙酸的酶基因poxB和pta阻断，得到菌株MGl655AptsGApoxBApta／pZYSE。对这个菌株进行发酵培养，甲羟戊酸的产量为284mg／L，进一步在发酵培养基中加入0．3％的甘油，甲羟戊酸的产量提高到747mg／L。通过基因敲除，甲羟戊酸途径起始物乙酰辅酶A和丙酮酸得到积累，增强3山东大学硕士学位论文了流向MVA途径的代谢流，甲羟戊酸产量的提高实验也证明了这一

5、点。甲羟戊酸途径的下游途径由mvaKl，mvaD，和mvaK2三个基因催化甲羟戊酸生成IPP。成功构建的含有这三个基因的载体pZYKDK可以和pZYSE共存，将这两个质粒共转化大肠杆菌后，一条完整的MVA途径在大肠杆菌体内构建成功，它和内源性DXP途径一起合成IPP和DMAPP。理论上增加MVA途径的代谢流量可以增加前体物IPP和DMAPP的积累，为利用大肠杆菌生产药用萜类提供基础。这个菌株可作为生产有价值萜类的平台，转入目的萜类合成酶基因，即可达到生产这种萜类的目的。关键词：甲羟戊酸；MVA途径；萜类；代谢工程；4山东大学硕士学位

6、论文ABSTRACTMevalonicacid，producedinthemevalonatepathway(MVApathway)ofmosteukaryotesandhigherplants，isaveryimportantorganicacid．Mevalonicacidcanbeusedasaneffectivesubstrateaddedtothemediumtosynthesizefunctionalterpenoids．Italsohaspotentialfunctionsinthechemicalindustry．T

7、hesehavecausedagreatneedonmevalonicacidproduction，especiallynatural3R—mevalonate．MVApathwayisaclassicalbiologicalpathwayemployedbymosteukaryotesandhighplantstosynthesizeisopentenylpyrophosphate(IPP)anddimethylallyldiphosphate(DMAPP)，whicharetheprecursorsofterpenoidssyn

8、thesis．HavingthesamefunctionwithMVApathway,anewlyfoundpathwayis1-deoxy—D—xylulose-5-phosphatepathway(DXPpathway)，whic