固定化葡萄糖氧化酶的制备及稳定性研究_许丽君

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1、２０１５年第２期化学教育（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｘｊｙ．ｏｒｇ）·３３·固定化葡萄糖氧化酶的制备及稳定性研究许丽君＊（绍兴市中等专业学校浙江绍兴３１２０００）摘要选用自制的磁性纳米四氧化三铁为酶固定化的载体，通过交联法来固定葡萄糖氧化酶。通过对酶固定化过程中一系列因素的研究，确定出酶固定化的最佳工艺为：交联剂戊二醛与浓度为０．７ｍｇ／ｍＬ酶液的体积比为１∶４，固定化时间为０．５ｈ，固定化温度为室温（≤２０℃），固定化所用缓冲液ｐＨ＝７。采用比色法测定其酶活力。结果表明葡萄糖氧化酶经过固定化后，其酶活力较游离酶显著增加

2、。固定化酶的热稳定性、酸碱稳定性、存储稳定性都有很大的提高。关键词葡萄糖氧化酶固定化磁性纳米载体酶性能ＤＯＩ：１０．１３８８４／ｊ．１００３－３８０７ｈｘｊｙ．２０１４０４０１２７葡萄糖氧化酶能使葡萄糖氧化，生成过氧化氢１．２实验药品和葡萄糖酸。由于微生物具有来源广、生长繁殖速实验药品见表２。度快等特点，故成为其主要来源。葡萄糖氧化酶最表２实验药品早发现于１９０４年，但直到１９２８年，科研人员才对名称规格厂家上海润捷化学试剂有限公司出品其性质进行研究，正式命名，并将其归入脱氢酶一水合柠檬酸（柠檬酸）ＡＲ江苏强盛化工有限

3、公司制造类。此后，Ｎａｋａｍａｔｓｕ、Ｆｉｅｄｕｒｅｋ、Ｒｏｇａｌｓｋｉ等对上海润捷化学试剂有限公司出品３０％过氧化氢ＡＲ葡萄糖氧化酶做了大量研究，现已投入生产使江苏强盛化工有限公司制造用［１］。葡萄糖氧化酶是同型二聚体分子，属于双体氯化亚铁ＡＲ上海展云化工有限公司戊二醛（质量分数５０％）ＡＲ天津市光复科技发展有限公司蛋白质，其每一个单体含有一个黄素腺嘌呤二核苷靛红（靛蓝二磺酸钠）ＡＲ天津市瑞金特化学品有限公司酸作为其辅因子。失去辅因子的葡萄糖氧化酶酶朊２实验方法就会丧失催化活性。葡萄糖氧化酶分子富含蛋白２．１Ｆｅ３Ｏ

4、４粒子的合成质，二级结构为１８％折叠结构和２８％螺旋结构，通过化学共沉淀法制备Ｆｅ３Ｏ４粒子，化学方三级结构为β－折叠结构。能与底物葡萄糖结合并发程式为：２Ｆｅ３＋２＋－＋Ｆｅ＋８ＯＨＦｅ３Ｏ４＋４Ｈ２Ｏ生催化反应。葡萄糖氧化酶为淡黄色粉末，易溶于分别移取４０ｍＬ的０．２ｍｏｌ／Ｌ的ＦｅＣｌ３溶液水，不溶于有机溶剂。葡萄糖氧化酶的分子量一般和０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＦｅＣｌ２溶液于三颈烧瓶中，于一定在１５万道尔顿左右，最适温度在５５℃左右，作用温度下，在精密增力电动搅拌器搅拌下，缓慢滴加温度在３０～６０℃，在２～８℃条

5、件下能稳定保存１一定体积的３ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液。滴加结束，年。葡萄糖浓度在５％～２０％范围内，底物浓度对继续搅拌一定时间，再超声一定时间，使其反应充［２］酶反应的影响不大，反应速度几乎不变。分。反应结束后，静置一段时间，去除上清液，用１实验仪器及药品蒸馏水反复洗涤至上清液无色，置于烘箱中烘干，１．１实验仪器备用。实验仪器见表１。２．２葡萄糖氧化酶的固定化表１实验仪器将Ｆｅ３Ｏ４粉末和酶液混合均匀，加入戊二醛名称规格溶液进行交联、离心，探讨酶与载体质量比、交联电动搅拌器ＪＪ－１电热恒温鼓风干燥箱ＤＧＧ－９０３０Ｂ剂

6、用量、ｐＨ、温度、时间等参数变化对固定化酶离心机ＬＧ１０－２．４Ａ的影响。电子天平ＪＡ５００３国华恒温水浴锅ＨＨ－４２．３固定化葡萄糖氧化酶活力测定方法超声波清洗器ＳＫ７２１０ＨＰ准确吸取０、２、４、６、８、１０、１２ｍＬ过氧化马尔文纳米粒度及电位分析仪ＺＳ９０国华恒温水浴锅ＨＨ－１氢标准溶液（１２ｍｇ／Ｌ），分别置于７只已编好号＊通信联系人，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｕｌｉｊｕｎｓｘ＠１６３．ｃｏｍ·３４·化学教育（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｘｊｙ．ｏｒｇ）２０１５年第２期的洗净烘干的５０ｍＬ的容量瓶，各加入２．６ｍＬ靛２０、３

7、０、４０、５０℃恒温水浴中放置０．５ｈ后，取红溶液（１．０×１０－３出。加入５ｍＬ０．２ｍｏｌ／Ｌ的葡萄糖溶液，放入恒ｍｏｌ／Ｌ）和６ｍＬｐＨ为４的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液，再加蒸馏水定容至刻度温水浴锅中，于３７℃下反应２０ｍｉｎ，再在沸水浴线，充分混匀，于沸水浴中反应１５ｍｉｎ，之后用中反应使其失活。冷却后直接加２．６ｍＬ靛红溶液水冷却５ｍｉｎ。在最大吸收波长６１０ｎｍ下，以蒸和ｐＨ为４的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液，定容后馏水做参比，测定其吸光度Ａ并记录结果。测其酶活力（其中加固定化酶液的一组进行吸光度固定化酶活力的测

8、定：用水将离心后附于离心测定时要先进行离心，取其离心液测吸光度）。管壁上的固定化葡萄糖氧化酶冲洗下来倒入其原来３．２游离酶和固定化酶的酸碱稳定性的５０ｍＬ容量瓶中。然后加入５ｍＬ０．２ｍｏｌ／Ｌ的取５０ｍＬ容量瓶１０只，分成２组，分别用于葡萄糖溶液，加水定容至刻度线后，放入恒温水浴测定游离酶和固定化酶的稳定性，每组各加１０ｍＬ锅中