逆转录试剂盒( transcriptor first strand cdna synthesis kit )操作步骤

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1、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 逆转录步骤1， 使用前解冻结冰的试剂2，将试剂短暂离心3，冰上操作：（操作RNA实验需要戴手套）将模板与引物 在PCR管上混合试剂体积最终浓度细胞总RNA 或1 ug 总RNA 或10ng 多聚尾(A)+m RNA多聚尾(A)+ mRNA任选其中一个引物:Anchored-oligo(dT)18 Primer, 1 ul2.5 uM50 pmol/ul (vial 5)或Random Hexamer Prim

2、er, 2ul60uM600 pmol/ul (vial 6)或 Sequence-Specific Primer可变0.5-2.5 uM1%DEPC水,  (vials 7 or 9)可变  使总体积为 13 ul总体积13ul注：以上为初次实验的推荐浓度。总RNA的适用浓度为10ug到5ng，以及mRNA的适用浓度为1到100ng,当RNA模板浓度较低时添加10ug/ml的MS2 RNA* 来稳定模板RNA。4，（可选）65度水浴上述混合物10分钟，使模板引物混合物变性（确保失活RNA二级结构

3、），水浴后立即冰浴至少一分钟5，往上述混合物继续加入以下试剂（冰上操作）试剂体积最终浓度.Transcriptor Reverse Transcriptase4 ul1×(8 mM MgCl2)Reaction Buffer, 5× conc. (vial 2)Protector RNase Inhibitor, 0.5 ul40 U/ul (vial 3)20 U Deoxynucleotide Mix, 2 ul每个1 mM10 mM each (vial 4) Transcriptor Re

4、verse 0.5 ul10UTranscriptase, 20 U/ul (vial 1)最终体积20 ul注：小心混合上述试剂，不要振荡，短暂离心使试剂沉在管底6，将PCR管放在PCR仪上孵育，孵育条件如下：使用的引物目标mRNA长度孵育温度与时间Anchored-oligo(dT)18不大于4kb55度30分钟大于4kb50度60分钟 primer, 50 pmol/ul 或Sequence–specific primerRandom hexamer primers, 不大于4kb25度10

5、分钟，然后55度30分钟600pmol/ul大于4kB25度10分钟，然后50度60分钟6,85℃水浴5分钟灭活逆转录酶8、－20℃保存，或立即进行PCR。注：Random hexamer primer: 主要用于细胞总RNA的逆转录A anchored-oligo(dT)18 primers ：主要用于多聚尾(A)+m RNA的逆转录