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1、华南师范大学学报(自然科学版)JournalofSouthChinaNormalUniversity(NaturalScience)1997(1):50～54水稻乙醇酸氧化酶的纯化和特性分析徐杰华南师范大学生物技术研究所广州510631摘要从水稻绿叶中分离纯化得到一种单亚基的乙醇酸氧化酶,其全酶分子量(Mr)约为260kD,电泳特性表明该酶的pI<8.3.我们用改进的8%PAGE,结合Westernblot,测定水稻绿叶中还存在一种pI>8.3的全酶Mr>669kD的乙醇酸氧氧化酶。关键词乙醇酸氧化酶;分子量;水稻中图分类号Q946.5乙醇酸氧
2、化酶(EC1.1.3.15简称GO)是光呼吸的关键酶,抑制其活性可显著提高C3植[1,2]物的光合效率,故研究重要的C3经济作物如水稻的GO具有重要意义,本文首次报导水稻乙醇酸氧化酶的纯化和分子量等特性。1材料与方法(1)3种水稻样品(水稻绿叶,黄化苗以及黄化苗经底物乙醇酸诱导)的获得水稻(Oryzasativa)种子经萌发后,部分在25℃下,经人工气候室培养20d,获得其绿叶;部分在相同条件下遮光培养20d,获得黄化苗;该黄化苗的一部分用于真空渗入底物乙醇酸,[3]方法按徐杰等。[4](2)水稻绿叶中GO的提纯和活性测定按徐杰和李明启。[5]
3、(3)蛋白质含量测定按Bradford。(4)提纯后GO的全酶Mr和亚基组成的测定[6]4%～20%PAGE和SDS-PAGE按张龙翔等,电泳缓冲液的pH=8.3,均采用垂直板电泳槽,其中4%～20%PAGE的电泳是从负极到正极进行,故只能测定pI<8.3的蛋白。5种标准蛋白为Pharmacia产品(5)水稻中高pI(>8.3)的GO的全酶Mr的测定由于经典的PAGE只能测定pI<8.3的蛋白Mr,而我们已证实在同一菠菜中存在3种不[7]同pI的GO,即pI>8.3,pI≈8.3和pI<8.3,它们的稳定性相差很大,用普通的纯化方法[4]难于得
4、到菠菜中pI>8.3的GO,我们用其中的一种SDS-PAGE为单带,pI<8.3的GO[3]为抗原制备了其抗体,在此基础上,我们用改进的PAGE,结合Westernblot,测定高pI(>8.3)的GO的全酶Mr。3本实验部分工作在中国科学院上海植物生理研究所植物分子遣传国家重点实验室中完成,并得到该实验室研究课题(104KF-9202)、国家自然科学基金和华南师范大学校内项目基金的资助。收稿日期:1995-09-1550a3种水稻样品的蛋白粗提液用20mmol/LTris-HCl(pH8.3)缓冲液提取,作8%[6]PAGE,电泳缓冲液同张龙
5、翔等,pH为8.3,PAG浓度改为单一的8%,采用垂直板电泳槽,[8]方向改为从正极到负极,以保证pI>8.3的蛋白能进入PAGE凝胶中;按Blake等,用GO抗体,采用Sigma试剂盒作Westernblot,以确定GO的迁移率,其中转移缓冲液的pH=8.3,方向也改为从正极到负极,以保证pI>8.3的GO能由PAGE凝胶中进入NC膜上,其中电泳和转移均在4℃下的Pharmacia的LKB系统中进行。b5种标准蛋白作8%PAGE,除电泳是从负极到正极进行和用考马斯亮蓝确定各自的迁移率外,其它条件均和a完全相同,其中的缓冲液和PAG均同一次配制
6、,垂直板电泳槽的PAG胶厚度一致,电泳时以并联方式同时进行,以保证pI<8.3的标准蛋白和绿叶中的pI>8.3的GO既都能出现在PAG上,又有相同的电泳条件,故其迁移率有可比性。2结果2.1GO的纯化经pH5.3酸沉淀和(NH4)2SO4分部沉淀,再经SephadexG-25分离,发现高GO比活组分位于蛋白洗脱峰的前面部分(洗脱曲线略),加适量的FMN,在DEAE-Cel2lulose柱层析中分离高GO比活组分,它们的洗脱曲线如图1所示。图1水稻GO的DEAE-Cellulose柱层析的洗脱曲线乙醇酸氧化酶活性只位Fig.1DEAE-Cellu
7、loseeludentcruveofglycolateoxidase于第2个洗脱峰(图1),将图fromricegreenleaves.1中的GO活性峰再经Sepharose-6B柱层析分离得到一个活性峰(图略)。2.2纯化后GO的纯度,亚基和全酶Mr的测定把纯化后的GO活性峰蛋白的一部分作SDS-PAGE以分析其纯度,可见为一条带(图2);另一部分作4%～20%PAGE,该GO的电泳特性表明其pI〈813,全酶Mr约为260kD(图3)。2.3pI>8.3的水稻GO的全酶Mr我们用不同的电泳方向,在相同的条件下使pI>8.3的GO和pI<8.
8、3的标准蛋白一起电泳,其中标准蛋白用普通方法染色;而GO则用GO抗体为基础的Westernblot来确定,图2水稻中经纯化的GO的结果表明在水稻绿叶粗
