Salusin—a基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

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1、砸循环学杂志，2010，20(1)：25～28⑥2010CHINESEJOURNALOFMICROCIRCULAT1ONSalusin—a基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达游莎曾和松[中图分类号]R541．4Q344．13[文献标识码]A[文章编号]1005—1740(2010)01—0025—04有限公司提供。脂质体(Lipofect2000)转染试剂为国一美国Invitrogen产品。1．2方法1．2．1THP一1细胞培养及RNA提取：THP一1细胞用1640培养基加10％胎牛血清，于37℃

2、、5CO。细胞培养箱中培养，常规换液、传代，用Trizol提取总RNA。1．2．2THP一1细胞Salusin—a基因的扩增：提取THP一1细胞总RNA逆转录，用RTPCR试剂盒合成Perprosalusin第一链cDNA。以Salusin—acD—NA为模板进行PCR扩增，Salusin～a上游引物序列：5一TGCTCGAGGGTGCCCTTCCTC一3；下游引物序歹U：5一TAGGATCCCGTCCCTTGGCTCCA一3，引物由上海生工合成。反应体系为50／,l，cDNA模板2pl，上下游引物各lul，2

3、．5mmol／LdNTP1／A，10×TaqDNA聚合酶缓冲液5,1，MgCL。4td，pfuDNA聚合酶1／A，ddH：O35l。扩增条件为94℃预变性2．5min，94。C1min，60。C1min，72℃2min，35个循环，72。C10min，获得Satusin—a目的1材料与方法片段，用1．5琼脂糖凝胶电泳鉴定，大量扩增并回1．1材料收PCR产物。人单核细胞系THP一】细胞、HEK293细胞购自1．2．3重组pEGFP—N3一Salusin—a质粒的构建：回武汉细胞典藏中心。增强型绿色荧光蛋白真核表达

4、收纯化Salusin—a片段和pEGFP—N3，同时用XhoI载体一N3(pEGFP—N3)和大肠杆菌DH5a感受肽细和BamH1双酶切(37

5、C，12h)，回收Salusin-a片段胞由本科实验室提供。1640及DMEM培养基购于和线性pEGFP-N3。用T4DNA连接酶连接Salusin-a美国Hyclone公司，胎牛血清为杭州四季青有限公片段和线性pEGFPN3。连接体系和条件：线性司产品。Trizol试剂、逆转录酶AMV合酶、PCR试pEGFPN32tLl，Salusin—a10“l，Buffer2．5

6、Ⅱl，T4DNA剂盒、T4DNA连接酶、限制性内切酶、凝胶回收试连接酶1>1，ddH2O9．5l，16℃，连接过夜。将重组剂盒及质粒小量抽提试剂盒由天根生化科技(北京)pEGFP-N3一Salusin-a转化DH5a感受态细胞，卡那霉素筛选平板培养过夜，挑取细菌克隆，小提质粒双酶[作者单位]华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科，邮政切、菌落PCR和测序鉴定，以确认pEGFP—N3一Sa—编码武汉430030；通讯作者：曾和松，Email：zenghesong@163．cornlusin-a质粒构建成功。大量

7、扩增该质粒备用。本文2009—09—30收到，2009—1026修回，20091202接受1．2．4pEGFP—N3一Salusin—a质粒转染HEK293：壤饵师学杂志基础与实验20】o年第20卷第1期26游莎．曾和松将HEK293细胞于10胎牛血清DMEM培养基计量数据以均数±标准差(±S)表示，多组间中培养至对数期。转染前24h，用0．25胰酶消化，比较采用One—WayANOVA单因素方差分析，两按5×10jcells／well接种于6孔板中至培养细胞约组间比较采用t检验，利用SPSS10．0软件进行统

8、65；转染前用无血清培养基培养细胞4h，将1．计学分析，P

9、粒对照组、转染细胞组，各组细胞培养24h后，用荧光显微镜观察其绿色荧光蛋白表达。采用流式细胞仪(BD公司，美国)获取转染数据。470bp1．2．6转染细胞Salusin—amRNA表达：收集以上HEK293细胞经PBS清洗后，加入Trizol裂解液，600bp按说明书提取总RNA，采用RT—PCR检测Salusin—500bp400bpamRNA的表达。PCR反应体系5Ol，反应条件：