cmv6xl4galc真核表达载体的构建及其在hek293细胞中的表达

《cmv6xl4galc真核表达载体的构建及其在hek293细胞中的表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、广东医学院硕士学位论文pCMV6-XL4/Galc真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达姓名：陈兰花申请学位级别：硕士专业：@指导教师：孙宁200905pcⅢ豇xL4／Galc真核表达载体的构建及其在HEl(293细胞中的表达摘要【目的】构建含半乳糖基神经酰胺酶(Galc)基因的真核表达质粒pCMv6．Ⅺj4／Galc，检测其在HEK293细胞中的表达情况，并探讨Galc基因对HEK293细胞增殖和凋亡的影响。【方法】从胎盘组织提取总l斟A，以此为模板，并设计带有EcoRI和SalI双酶切位点的特异性引物进行RT-PcR，扩增出目的基因片段，经回收、纯化后连接

2、到真核表达质粒载体pCMV6．xL4上，再转化感受态DH5Q工程菌扩增，利用载体的Amp抗性基因进行初筛，阳性克隆行酶切鉴定及测序鉴定。将鉴定好的阳性重组质粒pCMV6一xL4／Galc用Lipofcct锄ineTM2000介导转染HEK293细胞，同时设未转染组及转染pCMV6．XL4空质粒组为对照。转染48h后利用RT．PCR方法检测Galc基因mRNA在HEK293细胞中的表达，利用免疫细化和W馏tenlblot方法检测Galc蛋白的表达；以四氮唑盐(MTT)法及流式细胞术(FCM)分别检测Galc基因对HEK293细胞增殖和凋亡的影响。【结果】(1)重组质粒pC

3、MV6．XL削Galc经酶切后电泳，获得约为4．7kb的载体片段和3．8kb的目的片段，测序分析表明插入的片段与GenBaIll【发布的序列一致。(2)转染48h后，R-T．PCR及免疫细化结果显示，pCMV，6．XL4／Galc重组质粒组可见目的基因mRNA及蛋白的表达，而未转染组及pCMV6．xL4空质粒组几乎未见Galc基因的表达。(3)与未转染组及pCMV6一XL4空质粒组相比较，pCMV6-X【削Galc重组质粒组HEK293细胞的MTT结果显示细胞增殖受到明显抑制，流式细胞术结果则显示该组细胞凋亡明显增加，而未转染组及pCMV6．XL4空质粒组相比较则无明显

4、差异。【结论】(1)成功构建了pCMV6．XI削Galc真核表达质粒；(2)成功将Galc基因转染进HE勉93细胞；(3)转染Galc基因后，可以明显抑制HEK293细胞增殖，促进细胞凋亡。【关键词】半乳糖(基)神经酰胺酶(Galc)；人胚肾293细胞(HEK293cell)；载体构建；基因表达2TheConstructionofEukaryoteExpressionPlasmidpCMV6-Ⅺ4／GalcanditsExpressioninHEK293CeUABSTRACT【objec嘶e】T0constmctara渤nbin趾tcuk呻，0teexpresSionp

5、lasmidcontainingⅡlegelleofgalactosylcer锄id嬲e(Galc)缸ldstudytheexpreSsionofGalcgeneinHEK293cell1ille’勰wellastoinves石gatetlleeffectofGalcgenconnlep∞li向ation觚dapoptosisofnlatcellline．【Methods】T0talRNAeXtracted矗．omhumanplacelltatissue嬲t锄p‰廿1esp撕6cprime瑙ofGalcgeIleweredesi印edacC0rdingtoⅡ1eGalc

6、g铋e锄dⅡleVectorsequeIlce，锄dtlleGalcg朗ew嬲锄plifiedbyI弭PCR．Th吼mepurifiedGalcgcllew鹪lilll(cdt0tllepCMV6／XL4euk哪tcexpressionp1踟idVectort0cons仃Ilct舢mbin觚tp1锻nidpCMV6一XL4／Galc．nerecombinantplaSmidw嬲觚lsfo肌edint0E．coliDH5aandamplificated，Ⅱl饥scrc锄edbyAmpicillinresist趴cegeIle叽dideIltifiedbyeI：眨猡medi

7、gestion龇ldsequencillg．ThepositiVerccombin肌tpl器midw嬲仃ansienttransfectedintoHE勉93翻llineusingaro砸nelipofectaminemetllod．MeaIlwllile，no小锄dnegatiVep1煳id咖nsfectiongroupsweremade丛tlleconb．0ls．ARer48h，廿lemRNAofGalcgelleweredete啪inedbyRT—PCR，锄dtheproteindet阴nincdbyi眦Ⅶo哪och锄is时觚dWe