单只大型溞DNA的提取及其COI基因部分序列测定分析

《单只大型溞DNA的提取及其COI基因部分序列测定分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、第32卷第3期淮北师范大学学报(自然科学版)Vol．32No．32011年9月JournalofHuaibeiNormalUniversity(NaturalScience)Sep．2011单只大型DNA的提取及其COI基因部分序列测定分析彭树英，邓道贵，金显文(淮北师范大学生命科学学院，安徽淮北235000)摘要:利用基因组DNA纯化试剂盒稳定、快捷地提取单只大型(Daphniamagna)基因组DNA．以提取出的DNA为模板，利用线粒体DNA细胞色素氧化酶I亚基基因(COI)特异性引物，通过降落PCR技术扩增大型COI部分基因的序列．序列分析表明，此基因

2、确为大型COI部分基因片段，从而证明本研究所提取的线粒体DNA能够为进一步开展大型的种群遗传学研究、物种间的亲缘关系和系统进化及种质资源管理与保护等提供物质基础．关键词:大型;DNA的提取;COI基因中图分类号:Q394文献标识码:A文章编号:2095－0691(2011)03－0040－04水是一类在淡水生态系统中占有重要位置的小型浮游动物，普遍存在于池塘、湖泊和江河中，是生态学、进化生物学和环境科学等研究较为理想的模式生物[1]．但是，目前国内关于应用分子生物学技术对水的种群遗传学、物种间的亲缘关系和系统进化等方面的报道尚属空白．在分子生物学研究中，

3、DNA最好来源于单个个体[2－4]．如果运用传统分类进行鉴定的多个个体标本混合提取的DNA，很有可能影响分子生物学分类的精确性．对于水分类的研究，面临的一个难题就是如何从很小的个体提取足够量的DNA．因此如何简化操作，从单个个体获得高收率的DNA，成为水分子生物学分类中首要解决的问题．本研究采用试剂盒法提取单只及多只大型的基因组DNA．对线粒体DNA(mitochondrialDNA，mtD-NA)细胞色素氧化酶I亚基(cytochromeoxidasesubunitI，COI)基因进行扩增并进行序列分析，以证明使用此法所提取单只大型痕量DNA的可靠性．1

4、材料与方法1.1试验材料大型种由淮北师范大学生命科学学院水生生物学实验室培养并提供．1.2主要试剂蛋白酶K，RNaseA，2×TaqPCRMasterMix，D2000DNAmaker，基因组DNA纯化试剂盒(TIANampGe-nomicDNAKit)，琼脂糖购自天根生化科技(北京)有限公司;引物由上海英骏生物技术有限公司合成，其他试剂均为分析纯购自上海国药试剂公司．1.3试验方法1．3．1单只及多只大型基因组DNA的提取笔者曾尝试采用酚－氯仿法、CTAB法和DNA提取试剂盒等3种方法提取水基因组DNA(操作方法详见《不同方法提取水基因组DNA的比较》

5、)，经过比较，其中用试剂盒法提取的DNA效果最理想，而且快捷，高效．在提取单只大型基因组DNA同时，另设一对照组(提取4只大型基因组DNA)．收稿日期:2010－11－29基金项目:安徽省教育厅自然科学研究项目(2006KJ228B;2007B251Z)作者简介:彭树英(1977－)，女，内蒙古通辽市人，副教授，博士，主要从事发育生物学研究．第3期彭树英等:单只大型DNA的提取及其COI基因部分序列测定分析411．3．2引物设计根据GenBank中大型COI核酸序列(No．AY803069)，利用引物设计软件Primer5．0设计2条特异性引物，各项参数见

6、表1．表1引物序列、长度及退火温度序号序列长度/bp退火温度/℃COIS5'GAGCTGAGTTAGGGCAATC3'1952．0COIA5'ACCGCTCATACAAACAAGG3'1953．31．3．3PCR扩增分别以单只大型DNA和4只大型DNA为模板．PCR反应总体积为25μL，反应体系为:2条特异性引物各1μL，模板各加1μL，12．5μL2×MasterMix，补加9．5μLddH2O至25μL，混匀并瞬时离心．其中阴性对照中不加入2×MasterMix，其余成分同上，并用ddH2O补加至25μL．由于从单只大型中提取出来的DNA为痕量，故采用改

7、进的降落(touchdown，TD)PCR以提高反应特异性，以获得产量比较高的特异性DNA样品．TDPCR扩增程序如下:95℃，预变性5min;退火温度范围跨越10℃左右，从高于退火温度5℃到低于其5℃左右，每次退火温度降低0．5℃，在每个温度上循环1个周期(94℃，60s，X℃，40s，72℃，30s)，然后在退火温度48．5℃循环30个周期，最后72℃延伸10min．取5μLPCR反应产物进行电泳检测，利用凝胶成像系统观察结果．1．3．4序列分析PCR反应产物直接送交上海生物工程技术有限公司进行测序，将测得的COI基因核酸序列及据其推导的氨基酸序列与GenBa

8、nk中已有