肠炎沙门氏菌的分离鉴定与特异性检测方法的建立

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2、I，Ik上kl▲黼⋯⋯㈣⋯一I掣嬲嬲驾肠炎沙门氏菌的分离鉴定与特异性检测方法的建立专业：兽医专业学位研究生：陆广富导师：朱国强教授中文摘要沙门氏菌属于肠杆菌科细菌，由此类细菌引起的各种动物疾病

3、称为沙门氏菌病，除初生动物，人畜感染后一般呈无症状带菌状态，长期排菌，污染肉蛋产品，同时它们也可表现为有临床症状的致死疾病，可能加重病情或者增加死亡率，或者降低动物生产力等，对养殖业的经济效益影响重大。目前，鸡肠炎沙门氏菌污染禽蛋肉产品在全球范围内已是很严重的食品卫生问题。日、美等发达国家发生的食物中毒事件中很多都是由沙门氏菌引起的，肠炎沙门氏菌感染渐渐超越鼠伤寒沙门氏菌成为其最主要的病原菌。肠炎沙门氏菌引起鸡群发病的症状和病理学变化与鸡白痢沙门氏菌非常相似，所以在生产中常常把鸡源肠炎沙门氏菌感染症误诊为鸡白痢或伤寒。但是肠炎

4、沙门氏菌的贮藏宿主谱比白痢沙门氏菌广泛，该病的防治和普查要比鸡白痢困难得多，建立肠炎沙门氏菌快速特异性检测方法在养殖业，医学以及公共卫生界有重要意义。本研究中不仅成功从临床发病鸡场成功分离到肠炎沙门氏菌致病株，并根据肠炎沙门氏菌独特的染色体基因序列建立PCR方法特异性检测肠炎沙门氏菌，根据肠炎沙门氏菌独特的表面菌毛抗原蛋白建立间接ELISA方法特异性检测肠炎沙门氏菌感染血清。1肠炎沙门氏菌的分离与鉴定从江苏某发病鸡场发病死亡雏鸡体内分离出1株细菌，经形态学观察、生化特性、血清学鉴定以及PCR鉴定，该菌株被鉴定为D群沙门氏菌一肠

5、炎沙门氏菌，并命名为GY09。动物试验表明，该株细菌以ixl09cfu剂量腹腔注射小鼠，试验组小鼠在72小时内全部死亡，以lxl09cfu皮下注射3日龄SPF雏鸡，雏鸡在481誓扬州大学博士学位论文II一小时内全部死亡；而以3x109cfu剂量皮下注射17日龄SPF鸡，试验组鸡在3周试验期内全部存活。药物敏感性试验表明，该株细菌已对革兰氏阴性菌感染适用的常规药物，如环丙沙星、诺氟沙星、四环素、链霉素等产生完全耐药性，而对青霉素和头孢类药物保持较高敏感性。本试验研究表明，肠炎沙门氏菌早期感染是雏鸡高死亡率的一种重要病因。2肠炎沙

6、门氏菌SEFl4菌毛的抽提、纯化及生物学活性检测肠炎沙门氏菌在适合的体外培养条件下，抽提和纯化SEFl4菌毛蛋白并进行生物学活性的检测。本试验发现肠炎沙门氏菌在CFA培养液中，静止培养50h左右，SEFl4菌毛表达量相对较多，在机械高速匀浆后，菌体表面菌毛脱落后经迸一步的透析纯化，从而得到较纯的SEF14菌毛蛋白，蛋白大小和相关报道一致，约14KDa左右。Western咱10tting检测发现纯化的重组蛋白rSEFA(体外表达的SEFl4菌毛主要亚单位蛋白SEFA)免疫小鼠得到的高免血清能识别标准株肠炎沙门氏菌SEFl4茵毛蛋

7、白以及纯化的重组蛋白rSEFA，说明体外表达的rSEFA蛋白和体外抽提的SEFl4菌毛蛋白一样有较好的免疫原性和反应原性。3肠炎沙门氏菌特异性检测方法的建立本试验部分建立和优化了PCR方法特异性检测肠炎沙门氏菌以及重组蛋白rSEFA介导的间接ELISA方法特异性检测肠炎沙门氏菌血清抗体。Sdfl为肠炎沙门氏菌特有的一段基因，设计一对引物特异性检测肠炎沙门氏菌，以此PCR方法能成功检测2株肠炎沙门氏菌标准株，5株不同来源肠炎沙门氏菌临床分离株，而相同PCR条件下不能从都柏林沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等其他沙门氏菌和

8、其他同属肠杆菌科的常见致病菌染色体上扩增相应片段；本试验部分确定了间接ELISA方法抗原最佳包被量为7．5lag／ml，血清最适稀释度1t100，作用时间为60mim酶标二抗最适稀释度为1：4000，作用时间为60min；判定标准为oD值≥0．346，基于rSEFA介导的间接ELISA有较好的特异性，能特异性识别肠炎沙门氏菌和都柏林沙门氏菌感染血清，不能识别相近的鸡白痢沙门氏菌感染血清。这一方法的建立对肠炎沙门氏菌特异性抗体检测有潜在的应用前景。关键词：肠炎沙门氏菌，鉴定，SEFl4菌毛，抽提和纯化，间接ELISA’一ij陆广

9、富：肠炎沙门氏菌的分离鉴定与特异性检测方法的建立IsolationandidentificationofS．enteritidisanddevelopmentassaysfordetectionofS．enteritidisPh．D．Candidate：GuangfuLuSu