细胞色素P450酶诱导模型

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1、细胞色素P450酶诱导模型摘要细胞色素氧化酶P450是人体内一类参与内源性和外源性化合物代谢的重要代谢酶，代谢活化许多药物，前致癌物，前毒物，和质变剂。大约有60%的药物主要依赖细胞色素氧化酶P450的代谢作用清除的。本文主要建立了细胞色素P450酶的诱导模型，有望为研究新药提供参考。建立化合物对细胞色素P450酶的诱导的模型时，我们选择了利福平,奥美拉挫和苯巴比妥分别作为1A2,3A4和2B6酶的诱导剂。此模型使用肝细胞来建立的，化合物加入到细胞培养液中，通过LC-MS来从测定代谢产物的变化。同时,我们进行了基因水平的检测,在基因水平上

2、我们检测了化合物对细胞的诱导作用.通过此模型，我们可以直接从LC-MS测定的代谢产物的多少来确定未知的化合物是否对细胞色素CYP450是否有诱导作用。由实验得知，利福平,奥美拉挫和苯巴比妥对1A2,3A4和2B6的诱导能力很强，都超过20倍。7/7前言细胞色素P450(cytochrome,CYP450)是一类以还原态与CO结合后在450nm处具有最高吸收峰的含血红素的单链蛋白质。人体内代谢药物的主要酶就是细胞色素P450超家族(CytochromeP450proteins,CYP)，它们是一类主要存在于肝脏、肠道中的单加氧酶，多位于细胞

3、内质网上，催化多种内、外源物质的（包括大多数临床药物）代谢。P450酶能通过其结构中的血红素中的铁离子传递电子，氧化异源物，增强异源物质的水溶性，使它们更易排出体外。美国的一项研究表明，住院患者的严重不良反应发生率为6.7％，因药物相互作用的致死率已排名住院患者死亡原因的第4—5位[1]。近20年内，美国IDA先后已将批准上市的数十种新药从市场撤出，其最主要的原因就是出现了严重的药物代谢性相互作用[2]。诱导药物代谢是药物在代谢过程中诱导CYP450酶的表达或者CYP450酶的功能上调，从而加快药物的代谢速率，影响了临床药效或者引起药物中

4、毒的一种代谢方式。新药对CYP450酶的诱导作用已经越来越受国际医药界的重视，新药对CYP450酶诱导能力评价已经正式成为FDA的标准之一。生物体中的酶分为两种，分别为结构酶和诱导酶，CYP450酶是个很大的家族，其基因就超过了200种，一小部分基因数量稳定在细胞中被持续的转录和翻译，我们称之为结构酶，另一部分酶需要受到化学物质或者激素的刺激才能被表达，我们称之为诱导酶。药物对细胞色素P450产生诱导的主要机制是基因转录水平的提高。绝大部分的CYP450酶的基因转录的增加是通过核受体介导的机制。CYP酶的基因活化主要有三种受体调控：孕烷X

5、受体（PXR）,雄烷受体(CAR)，和芳烃受体（AhR）。【3】正常情况下，核受体与其对应的阻截物结合，保证基因转录水平的稳定性，但是当诱导药物存在时，药物会和受体配基的结合区域结合，并且使阻截化合物解聚，从而促使染色质变质和基因转录。【4】CYP450酶的家族很大，主要分为三类：CYP1家族，CYP2家族，CYP3家族[27,28]。我们在实验中选取了CYP450酶的1A2，3A4和2B6进行了诱导能力的评价。CYP3A4，CYP1A2和CYP2B6的诱导分别由PXR，CAR和AhR介导，因此我们对CYP450家族进行的体外诱导实验只需

6、要选取这三个酶就可以了。根据FDA的报道利福平,奥美拉挫和苯巴比妥分别是1A2,3A4和2B6酶强7/7诱导剂，所以我们选取了这三个化合物来进行我们的实验。研究CYP450酶的诱导主要有肝实质细胞培养法，肝切片法，基因重组P450酶系以及肝灌流技术。2实验方法2.1主要试剂及器材试剂：化合物（底物，内标和诱导剂）：非那西汀（Phenacetin）和咪达唑仑（Midazolam）和安非他酮（Bupropion），对乙酰氨基酚-d4（Acetaminophen-d4），1'-OH-咪达唑仑-13C3（1'-OH-Midazolam-13C3）

7、，利福平（Rifampicin）,奥美拉挫（Omeprazole）,PBS（磷酸缓冲溶液），DMEMF12购买于西格玛。甲醇，乙腈和醋酸胺是色谱级均购买自美国Sigma-Aldrich公司。甲酸是色谱级购买自美国TEDIA。主要酶体系：人的肝细胞购买于IVT。仪器：样品分析采用API5500：串联质谱样品分析采用应用生物API5500三重四级杆质谱仪(安大略，加拿大)配有电喷雾离子源，接口处连接WatersACQUITYUPLC®(Waters，美国)液相系统，液相系统配有二元泵，自动进样器，柱温箱。液相系统和数据采集均由Analyst1

8、.5.1软件控制，软件来源于美国应用生物公司。2.2常用试剂的配制（1）磷酸盐缓冲溶液（100mM磷酸钾溶液）配制溶液1:精密称量136.5克磷酸钾，加1L蒸馏水溶解。配制溶液2：精密称量17