researchdevelopment免疫学检测技术

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1、免疫学实验技术Immunologicalexperimenttechnique一、免疫细胞分离与功能测定技术1.免疫细胞分离与纯化2.免疫细胞功能测定二、免疫分子的检测技术1.细胞膜分子2.可溶性分子1.免疫细胞分离与纯化(B细胞、T细胞、NK细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、DC、红细胞等)2.免疫细胞功能测定一、免疫细胞分离与功能测定技术1）单个核细胞分离◆葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法◆Percoll不连续密度梯度离心法除去分离单个核细胞层单核细胞淋巴细胞BT1、免疫细胞分离与功能测定1）单个核细胞分离◆多次洗涤除去血小板◆低渗或氯化铵

2、溶解红细胞◆黏附除去单核细胞◆L亮酸甲酯除去单核细胞、NK、Tc◆集团铁除去单核细胞◆免疫吸附分离除去单核细胞◆免疫磁珠分离除去单核细胞2）淋巴细胞纯化◆尼龙棉柱分离6mmT细胞B细胞3）B细胞、T细胞分离◆E花环分离CD2CD2CD2CD2TSRBC离心获得T细胞3）B细胞、T细胞分离◆免疫吸附分离羊抗鼠Ab3）B细胞、T细胞分离TBB鼠抗人CD3mAbTBBBB◆免疫磁珠分离法免疫磁珠法分离细胞细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接

3、着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。◆免疫磁珠分离法免疫磁珠法分为阳性分离法和阴性分离法：阳性分离法－磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞阴性分离法－磁珠结合不需要的细胞，游离细胞为所需细胞一般而言，阴性分离法的磁珠用量比阳性分离法的大，阳性分离法用行更多。磁珠分离细胞的重要指标是：   纯度和得率：取决于磁珠所连接单抗的特异性和磁珠大小（磁性），然而太大的磁珠会影响细胞活性。目前市场上有2种磁性细胞分离系统：*Smallparticles(≈50nm)－MACS*Largeparticles(1

4、200~4500nm)－others（如Dynal）小磁珠优点：分离后续培养、可上流式检测缺点：强的磁场、速度慢得率低、成本昂贵大磁珠优点：试管中完成（简单）、易于增减细胞用量、速度快得率高、成本低；缺点：影响细胞活性不利于培养、纯度低、容易阻塞FCM的喷嘴 ；优点与缺点◆flowcytometry◆T细胞增生(转化)试验◆T细胞介导的细胞毒试验原理◆T细胞功能的体内检测法◆流式细胞术◆T分泌细胞因子功能测定4）T细胞功能测定◆T分泌细胞因子功能测定◆T分泌细胞因子功能测定◆T分泌细胞因子功能测定◆T分泌细胞因子功能测定◆B细胞转化试验

5、◆溶血空斑形成试验◆反向溶血空斑试验◆酶联免疫斑点法5）B细胞功能测定◆酶联免疫斑点法◆酶联免疫斑点法◆酶联免疫斑点法◆酶联免疫斑点法1)形态学检查法2)51Cr放射性核素释放法3)酶释放法：4)化学发光法5)流式细胞术6）NK细胞活性测定51Cr放射性核素释放法6）NK细胞活性测定1)中性粒细胞趋化功能测定2)中性粒细胞吞噬功能测定7）吞噬细胞功能测定3)巨噬细胞吞噬功能测定4)巨噬细胞胞毒作用7）吞噬细胞功能测定8）DC分离与纯化分离DC的原理是依据树突状细胞的低密度和半粘附特性:具有轻度暂时性粘附特性----从而可以和其他非粘附细

6、胞、巨噬细胞；8）DC分离与纯化◙小鼠脾脏DC是1974年首次分离获得的：利用DC半粘附性将脾脏内单个核细胞培养3小时后，洗去非粘附细胞（淋巴细胞），纯度约为40%-60%；◙采用培养板亲和粘附提高了DC的纯度80-90%，操作方便、花费小、但提取的量较少；8）DC分离与纯化◙免疫磁珠法分离（CD11c）◙分离诱生法:主要是采用直接分离和细胞因子诱生相结合的方法,依次去除红细胞、T、B细胞、粒细胞、单核-巨噬细胞等而获得纯化树突状细胞及其前体，再联合细胞因子诱导下培养；◙应用细胞因子诱导人体CD34细胞定向分化为树突状细胞近年来已有大量

7、文献报道；9）红细胞功能测定1930年Duke和Wallace发现锥虫在抗血清及补体参与下，可黏附到人类红细胞膜上，并发现不同人红细胞对锥虫的黏附能力不同，推测在红细胞膜上存在者一种与免疫有关的物质。1953年Nelson报道，Ⅰ型肺炎双球菌可以被补体调理结合到人红细胞膜上，此现象称为免疫黏附，这种黏附需激活补体C3，而不需要激活下游的补体成分，认为红细胞膜上可能存在免疫黏附受体。9）红细胞功能测定直到1963年Nishioka证实这种免疫黏附现象是通过人红细胞膜补体C3受体(现称CRl或CD35)而实现的。1980年Fearon详细研

8、究CD35性质，表明85%的CD35存在红细胞膜上。1981年Siegel在前人研究的基础上发现红细胞可黏附肿瘤细胞、血清中存在抑制红细胞黏附因子、红细胞膜上过氧化物酶活性与CD35活性相关等多种免疫功能，