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1、MicroRNA在基因表达调控中的作用一.怎样定义miRNA(成熟)1,长度为22nt的转录体.可通过northernblot等方法检测得到.2,其前体为典型的发卡结构.miRNA位于发卡结构的茎部分..3,通过Dicer酶的处理后生成.4,序列具有高度的保守性.二.miRNA的生成过程注意事项:1,通过RNA聚合酶II转录生成.具有mRNA的结构特征2,可以是多顺反子结构.即一条pri-miRNA包含多个成熟miRNA的信息.3,在判断一非编码蛋白质的mRNA是否生成miRNA时,我们可以通过抑制Drosha的活性,观察pri-miRNA的含量是否增加.4,miRN
2、A可来源于外显子,也可来源于内含子和非编码序列.5.miRNA在基因组DNA上成族分布,处于同一族的miRNA常共表达三.miRNA的作用机制及功能作用机制:与靶基因mRNA3-非翻译区通过不完全配对结合降低mRNA稳定性或抑制靶基因的翻译.此外,miRNA也可与5-非翻译区和编码区序列结合调节靶基因的表达.有文献报道,miRNA可与mRNA3-非翻译区的其他部位结合,升高mRNA的稳定性.注意事项:1,由于miRNA与靶序列是通过不完全配对结合,因此证实miRNA的靶基因成为一难点.2,一种miRNA常有多个靶基因.功能:miRNA主要通过抑制它的靶基因来起调控作用
3、。miRNA的作用遍及生命体的发生、生长、发育、分化和死亡的过程。Lewis等人的预测结果发现，预测的miRNA的靶基因多数是参与转录、信号转导、肿瘤发生的基因。虽然miRNA的作用也是特异的，特别是5'端的2～8个碱基，特异性的靶向与它的靶基因，但是与siRNA不同的是miRNA的特异性并不是那么强，在生物体内往往一个miRNA作用于多个靶基因6.对于同一家族miRNA,其功能常具有互补作用.比如:在MYC诱导的B细胞淋巴瘤小鼠模型中,剔除miR-17-92族DNA序列可诱导凋亡,如果导入此族中的任意一种miRNA均可减轻细胞凋亡.7.不同miRNA可同时调节同一靶
4、mRNA1.miRNA与细胞增殖apoptosis转录因子p53miR-34aStress(H2O2,UV等)Proinflammatorycytokine转录因子NF-kBmiR-146(1)IL-1receptor-associatedkinase1(2)TNFreceptor-associatedfactor6抑制cytokinesignaling2.miRNA与细胞凋亡3.miRNA与细胞信号传导四.microRNA表达的特点1,时间特异性在高等生物,microRNA的表达在生长发育的不同阶段是不同的..2,组织特异性在不同的组织中,microRNA的表达不同
5、的四.寻找miRNA基因1.Forwardgenetics2.MiRNAcloning3.ComputationalapproachestomiRNAdiscovery五.检测miRNA表达的方法1,Northern杂交2, Real-timeRT-PCR3.基因芯片的方法六．怎样预测miRNA的靶基因第一种方法:过表达或抑制miRNA的表达,利用基因芯片筛选出差异表达基因.从这些差异表达的基因中,证实miRNA的靶基因.注意事项:1.并非所有的差异表达基因都是miRNA的靶基因.许多差异基因表达的改变是由靶基因表达的改变而引起.miRNA转录因子p53P53的靶基因
6、P53的靶基因不是该miRNA的靶基因2.该方法不能证实miRNA所有的靶基因.根据miRNA与靶基因mRNA3’UTR的配对程度不同,miRNA可降解靶基因mRNA(配对程度高),也可不降解靶基因mRNA(配对程度低)但抑制mRNA的翻译,第二种方法:由生物信息学预测miRNA的靶基因.预测miRNA靶基因的网站:http://www.microrna.org/mammalian/index.html.http://pictar.bio.nyu.edu/http://www.microrna.org/microrna/home.dohttp://www.target
7、scan.org/注意事项:根据背景知识,选择两个或两个以上网站均有预测的靶基因做进一步分析七．怎样证实miRNA的靶基因5’UTR3’UTRORFAAAAAAAAA靶基因mRNAPCR扩增3’UTR克隆3’UTR到报告基因luciferase下游luciferase3’UTR报告载体将重组载体转染细胞,观察过表达或抑制miRNA后,luciferase活性是否改变.为进一步证实miRNA确实调节该靶基因,还需完成以下实验1,突变3’UTR上与miRNA结合序列(主要是种子序列),观察突变后的3’UTR可否废除miRNA对luciferase活性的影
